Îmbunătățirea solubilității proteinelor recombinante folosind eticheta MBP

Resurse „Centre de resurse tehnice „Resurse tehnice pentru proteine „Resurse tehnice pentru proteine „Resurse tehnice Note „Eticheta MBP

E. Expresia coli

Generarea de proteine recombinate necesită utilizarea unei gazde de expresie, iar E. coli este, de obicei, alegerea de top în acest scop. Combinația dintre o genetică simplă, ușurința de cultivare, expresia rapidă și randamentele ridicate o fac o gazdă atractivă, în timp ce lipsa unui mecanism posttraducțional eficient, utilizarea părtinitoare a codonilor și dificultatea de a produce proteine cu greutate moleculară mai mare, o face dezavantajoasă. Cu toate acestea, unul dintre cele mai mari rele ale expresiei E.coli este expresia insolubilă – fenomenul în care supraexprimarea recombinantă duce la formarea de agregate proteice insolubile numite corpuri de incluziune.

Modalități de tratare a corpurilor de incluziune și de îmbunătățire a solubilității proteinei țintă

Când se formează corpuri de incluziune, oamenii de știință încearcă de obicei un proces greoi numit solubilizare și repliere a proteinei in vitro pentru a recupera proteina solubilă sau încearcă optimizarea expresiei la nivel de proces sau molecular pentru a preveni problemele de insolubilitate .

Exemplele de optimizare la nivel de proces includ metode care nu necesită ingineria țintei. De exemplu, optimizarea condițiilor de expresie, ajustarea condițiilor de creștere și inducție, schimbarea mediilor, a tampoanelor etc. O alternativă ar fi să se încerce o abordare moleculară și să se manipuleze proteina țintă prin eliminarea elementelor nedorite din cadrul secvenței sale prin crearea de trunchieri sau prin mutarea anumitor aminoacizi pentru a face proteina mai solubilă. Ați putea, de asemenea, să adoptați o abordare rațională, de mutageneză dirijată pe site, bazată pe informații privind structura sau să adoptați o abordare de evoluție dirijată și să testați solubilitatea unor mutanți punctuali, deleții și fragmente aleatorii. O abordare mai bună și mai ușoară ar fi să adoptați o strategie a partenerului de fuziune și să folosiți un partener de fuziune în amonte care să facă proteina țintă mai solubilă.

Abordare a partenerului de fuziune pentru îmbunătățirea solubilității proteinelor

Utilizând această abordare, o proteină sau peptidă greu de exprimat este fuzionată cu o altă proteină stabilă, foarte solubilă, pentru a stabiliza expresia, în ideea că proteina de fuziune va conduce expresia rezultată. Deși multe proteine sunt foarte solubile, nu toate sunt eficiente ca amelioratori de solubilitate a proteinelor. În acest sens, proteina de legare a maltozei poate fi un partener foarte util pentru solubilitatea proteinelor . Într-un studiu comparativ orientat spre investigarea proprietăților lor de îmbunătățire a solubilității proteinelor, eticheta MBP din E. coli s-a dovedit a fi un partener de solubilitate a proteinelor mult mai eficient decât proteinele Glutation-S-transferază (GST) și Tioredoxină (TRx).

Figura 1: Recomandarea cercetătorilor de la GenScript cu privire la proiectarea construcției

Despre tag-ul MBP și mecanismul său de acțiune

MBP este o proteină de aproximativ 42 kDa, prezentă în mod natural în E. coli, codificată de gena malE, care este responsabilă pentru absorbția, descompunerea și transportul maltodextrinei, un carbohidrat. Dezvoltată inițial ca un marker de expresie a proteinelor în anii 1980, este cunoscută pentru faptul că sporește semnificativ solubilitatea unei varietăți de proteine țintă fuzionate în aval. Deși mecanismul exact de creștere a solubilității proteinelor de către eticheta MBP nu este clar, se știe că aceasta stabilizează și protejează proteina pasageră din aval de degradarea proteolitică în timpul și după sinteza proteinelor. De asemenea, randamentele citoplasmatice ale proteinelor fuzionate cu MBP sunt, de obicei, mai mari, deoarece proteina de fuziune oferă contexte fiabile pentru inițierea eficientă a traducerii. S-a propus, de asemenea, că eticheta MBP ar putea acționa ca un chaperon prin interacțiuni prin intermediul unui punct fierbinte expus la solvent de pe suprafața sa, care stabilizează proteina pasageră, altfel insolubilă.

Utilizarea etichetei MBP

În timp ce s-a demonstrat că eticheta MBP fuzionată fie la N-terminal, fie la C-terminal a crescut expresia solubilă recombinantă, o abordare comună este fuzionarea acesteia la N-terminal. Din nefericire, deoarece niciun marcaj nu poate fi ideal pentru toate aplicațiile, pentru a crește versatilitatea marcajelor și a aplicațiilor din aval, au fost dezvoltate metode de marcare combinatorie pentru diverse nevoi. Două etichete de afinitate exprimate în tandem, împreună cu un situs de clivaj al proteazei care precede proteina țintă, permit utilizarea mai multor strategii de purificare. Prin încorporarea unui marcaj de creștere a solubilității în combinație cu un marcaj de purificare, se obțin îmbunătățiri ale solubilității proteinelor și ale randamentelor de expresie, precum și metode de purificare eficientă

Figura 2: O schemă generală pentru strategia de proiectare a construcției – o combinație de marcaj de afinitate/solubilitate la extremitatea N-terminală, un situs de clivaj proteolitic urmat de proteina țintă poate da rezultate bune, în special pentru proteinele țintă insolubile. O secvență de legătură poate ajuta adesea la rezolvarea problemelor de clivaj proteolitic.

Purificarea proteinelor marcate cu MBP

În afară de îmbunătățirea solubilității proteinelor, un alt avantaj al utilizării unei strategii de fuziune MBP este facilitarea purificării proteinei țintă din aval. MBP este o etichetă de afinitate naturală care se leagă de rășina de amiloză și poate fi utilizată pentru purificarea de afinitate într-o singură etapă prin legarea la amiloza reticulată. Proteinele recombinate MBP cu marcaj MBP legate de amiloză imobilizată sunt de obicei eluate în condiții nedenaturante folosind maltoză .

Dezavantaje ale acestei strategii

• Scindarea proteinei țintă poate fi o problemă din cauza impedimentului steric din partea tag-ului MBP
• Rezina de amiloză poate fi fragilă și relativ scumpă
• Precipitarea proteinei țintă după scindare
• Câteva proteine de fuziune MBP nu se leagă eficient de rășina de amiloză și chiar și atunci când o fac, randamentele pot fi o problemă

Concluzie

În timp ce nu există o soluție simplă, globală pentru a rezolva problemele de insolubilitate în E.coli, o construcție bine concepută și o strategie de expresie atent elaborată vă pot oferi proteina solubilă dorită. MBP este o etichetă de solubilitate fiabilă pentru producția de proteine solubile recombinante și, deși solubilitatea este unul dintre cele mai importante elemente ale unei campanii de producție de proteine, obiectivul final nu ar trebui să se refere întotdeauna la solubilitate. Nivelurile de expresie, activitatea proteică, puritatea, omogenitatea și stabilitatea sunt toți factori importanți care trebuie, de asemenea, luați în considerare înainte de a se lansa într-o campanie de producție de proteine recombinate.

Câteva publicații care demonstrează utilitatea marcajului MBP

Producerea de fusokine folosind MBP -Maltoză-Binding Protein Fusion Allows for High Level Bacterial Expression and Purification of Bioactive Mammalian Cytokine Derivatives (septembrie 2014)

The rescue of aggregation-proteine predispuse la agregare cu ajutorul MBP -Rezervarea proteinelor predispuse la agregare în Escherichia coli cu un marcaj dublu His₆-MBP (mai 2014)

MBP pentru producerea de proteine solubile în E. coli -Proteina de legare a maltozei marcată cu hexahistidină ca partener de fuziune pentru producerea de proteine recombinante solubile în Escherichia coli (2009)

1. Pryor, K. A., și Leiting, B. (1997). Exprimarea la nivel înalt a proteinei solubile în Escherichia coli utilizând un sistem de fuziune cu dublă afinitate His6-tag și proteină de legare a maltozei. Protein Expr. Purif. 10, 309-319
2. Routzahn, K. M. și Waugh, D. S. (2002). Efecte diferențiale ale etichetelor de afinitate suplimentare asupra solubilității proteinelor de fuziune MBP. J. Struct. Funct. Genomics 2, 83-92
3. Nallamsetty, S., Austin, B. P., Penrose, K., J., și Waugh, D. S. (2005) Vectori Gateway pentru producerea de proteine de fuziune His6-MBP marcate combinatoriu în citoplasma și periplasma Escherichia coli. Protein Sci. 14, 2964-2971
4. Esposito D, Chatterjee DK: Îmbunătățirea expresiei proteinelor solubile prin utilizarea etichetelor de fuziune. Curr Opin Biotechnol 2006, 17:353-8.184.
5. Peti W, Page R: Strategies to maximize heterologous protein expression in Escherichia coli with minimal cost. Protein Expr Purif 2007, 51:1-10.]
6. Wilkes D.M., Expression and purification of the first nucleotide-binding domain and linker region of human multidrug resistance gene product: comparison of fusions to glutathione S-transferase, thioredoxin and maltose-binding protein. Biochemical Journal 1999, 77-81
7. Fox JD, Kapust RB, Waugh DS: Substituțiile unui singur aminoacid de pe suprafața proteinei de legare a maltozei din Escherichia coli pot avea un impact profund asupra solubilității proteinelor de fuziune. Protein Sci 2001, 10:622-630

Planificați un proiect de expresie bacteriană? Obțineți o ofertă gratuită în câteva secunde pentru pachetele noastre de expresie proteică garantată BacPower™.

Oferte și comenzi

#Oferta automată va fi generată numai dacă secvențele se califică pentru serviciul garantat, așa cum a fost determinat de platforma noastră brevetată de analiză a secvențelor, în caz contrar, managerul nostru de cont tehnic vă va contacta cu o ofertă de producție de proteine personalizate. Vă asigurăm că serviciile noastre personalizate sunt la fel de calitative și competitive ca și serviciile noastre Garantate.

Reprezentanții serviciului nostru de relații cu clienții sunt disponibili 24 de ore pe zi, de luni până vineri, pentru a vă ajuta.

.