Izolarea și identificarea substanțelor volatile
Narul uman percepe mulți COV ca mirosuri și aceste mirosuri sunt adesea primul nostru indiciu că sunt prezente mucegaiuri. Cu toate acestea, caracterizarea chimică (izolarea, separarea, identificarea și cuantificarea) a COV-urilor necesită metode analitice specializate, diferite de abordările utilizate în chimia „umedă” tradițională. Progresele tehnologice de la sfârșitul secolului al XX-lea și începutul secolului al XXI-lea au îmbunătățit capacitatea noastră de a detecta substanțele volatile cu precizie, acuratețe și la concentrații scăzute (Zhang și Li, 2010; Hung et al., 2015). Pe scurt, metodele tradiționale implică distilarea cu abur și extracția lichid-lichid, urmate de concentrarea și verificarea chimică a compușilor individuali. Unele dintre primele studii privind natura chimică a COV-urilor au fost realizate cu ajutorul extractelor de clorură de metilen care au fost concentrate prin distilare cu abur și analizate prin cromatografie gaz-lichid și spectrometrie de masă (SM). Într-un prim studiu care a utilizat această abordare, au fost analizați COV din Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus oryzae și Aspergillus parasiticus. Toate cele patru specii au produs 3-metilbutanol, 3-octanonă, 3-octanol, 1-octen-3-ol, 1-octenol și 2-octen-1-ol. Pentru A. niger, peste 90% din amestecul de COV identificat a constat din 1-octen-3-ol, care este compusul olfactiv care conferă ciupercilor mirosul lor caracteristic. Pentru A. parasiticus, 1-octen-3-ol reprezenta 35,6% din amestecul volatil total, în timp ce compusul înrudit cu opt atomi de carbon, 2-octen-1-ol, care are un miros neplăcut de ulei de muștar, constituia 34,8% (Kamiński et al., 1974).
De atunci, metodele s-au bazat pe cromatografia în fază gazoasă-spectrometrie de masă (GC-MS), care combină separarea cromatografică, identificarea prin spectrele de masă și retenția cromatografică, precum și cuantificarea probelor volatile. COV din spațiul de căpătâi al culturilor fungice sunt, de obicei, colectați de materiale solide absorbante, cum ar fi cărbunele activat sau o fibră. Fiecare metodă de colectare are prejudecăți înnăscute și poate permite formarea de artefacte; în general, compușii nepolari sunt recoltați cu predilecție față de cei polari. Cromatografia în fază gazoasă poate introduce, de asemenea, erori în sensul că uneori este dificil de separat doi compuși unul de celălalt, ceea ce duce la confundarea lor. Acest lucru a fost observat în cazul 2-metil-1-butanolului și 3-metil-1-butanolului, izomeri care diferă doar prin transpunerea unei grupări metil (Börjesson et al., 1992). Alte dezavantaje ale analizei GC-MS includ nevoia de operatori calificați, cheltuiala sa relativă și faptul că nu este eficientă în cazul COV-urilor mai reactive (Elke et al., 1999; Gao et al., 2002; Gao și Martin, 2002; Rappert și Müller, 2005).
Microextracția în fază solidă (SPME) este o metodă populară și portabilă. COV sunt mai întâi absorbiți și concentrați pe o fibră, iar ulterior sunt livrați la detector, unde are loc desorbția în injectorul GC propriu-zis. SPME este foarte potrivită pentru prelevarea de probe de mediu care sunt apoi transportate înapoi în laborator pentru identificare. Împreună cu GC-MS, este un mijloc convenabil și utilizat pe scară largă pentru identificarea calitativă a COV-urilor din culturile microbiene sau din clădirile contaminate (Fiedler et al., 2001; Wady et al., 2003; Jeleń și Grabarkiewicz-Szczesna, 2005). SPME este adesea cea mai bună abordare pentru determinarea cantității relative a unui compus volatil țintă într-o situație exploratorie sau pentru procese de eșantionare repetitive. Cu toate acestea, nu este utilă pentru identificarea compușilor noi.
Au fost dezvoltate multe metode analitice specializate care completează abordările clasice GC-MS și pot fi utile pentru analize specifice. De exemplu, reacția de transfer de protoni-spectrometrie de masă (PTR-MS) este utilă pentru prelevarea rapidă de probe și pentru detectarea concentrațiilor scăzute (Kamysek et al., 2011; Schwoebel et al., 2011). Această metodă a fost utilizată în știința mediului, în tehnologia alimentară și în diagnosticul medical (Gasperi et al., 2001; Cappellin et al, 2013).
Utilizând desorbția termică (TD)-cromatografie în fază gazoasă/spectroscopie de masă, profilul de metaboliți volatili in vitro al Aspergillus fumigatus a fost caracterizat, indicând o semnătură distinctivă care conține monoterpenele camfen, α- și β-pinen și limonen; și compușii sesquiterpenici α- și β-trans-bergamotene (Koo et al, 2014).
Spectrometria de masă cu tub de flux ionic selectat (SIFT-MS) are capacitatea de a detecta COV microbieni cu rapiditate și sensibilitate într-un amestec de gaze moderat de complex. Aceasta este capabilă să vizeze COV la concentrații mici de o parte pe miliard și poate măsura anumiți compuși în intervalul de o parte pe trilion. În această tehnică, COV totali sunt ionizați în cadrul unui tub de curgere, nefiind necesară separarea cromatografică (Syhre et al., 2008; Chambers et al., 2011). Metoda a fost utilizată pentru a cuantifica COV emiși de A. fumigatus în cocultură cu bacterii care se găsesc adesea în plămânii umani bolnavi. Culturile cu A. fumigatus au produs cantități „copioase” de amoniac și de compuși organosulfurați metanethiol (cunoscut și sub numele de metil mercaptan), sulfură de dimetil și disulfură de dimetil (Chippendale et al., 2014).
Extracția prin distilare simultană (SDE) include o fibră scurtă de silice acoperită cu material organic ca fază staționară pentru a concentra COV care sunt apoi desorbiți într-un injector fierbinte. SDE a fost utilizată pentru determinarea componentelor volatile în analizele de mediu, alimentare, criminalistice, petroliere, farmaceutice și de polimeri, pentru a obține probe mai concentrate (Orav et al., 1996). De exemplu, anumiți compuși aromatici au fost studiați folosind o combinație de SDE și SPME. Compușii de aromă pot fi analizați cantitativ prin SDE, în timp ce SPME este utilizat pentru un screening simplu, rapid și de rutină (Cai et al., 2001).
Spectrometrul de mobilitate ionică cu coloană multicapilară (MCC-IMS) are o sensibilitate până în intervalul de o parte pe trilion, este de mare viteză și necesită cunoștințe tehnice reduse. Metaboliții caracteristici ai speciilor de A. fumigatus și Candida au fost diferențiați în analiza spațiului capului prin această abordare (Perl et al., 2011).
Nazurile electronice (e-noses) traduc substanțele volatile în semnale electrice pe baza interacțiunii cu suprafețele electronice și pot fi utilizate pentru detectarea compușilor cunoscuți. Nasurile electronice sunt compuse dintr-un grup de senzori chimici cu selectivități diferite, o unitate de preprocesare a semnalelor și un sistem de distincție a modelelor (Gardner și Bartlett, 1994). Diferiți COV formează o amprentă caracteristică care poate fi distinsă prin comparații cu modelele înregistrate anterior în sistemul de recunoaștere. Aplicația medicală a nasului electronic s-a axat inițial pe agenți patogeni bacterieni sau pe boli neinfecțioase, cum ar fi cancerul pulmonar, boala pulmonară obstructivă cronică și astmul (Valera et al., 2012). În funcție de aplicație, eșantioanele de COV din tampoane, spută, ser, fecale, respirație sau urină sunt utilizate în scopuri de diagnosticare. Probele de respirație au fost utilizate pentru detectarea precoce a aspergilozei (de Heer et al., 2013).
Rămân multe provocări tehnice în lucrul cu COV fungici și este adesea dificil să se compare rezultatele obținute între diferite laboratoare. Aceeași specie fungică poate avea profiluri diferite de COV pe baza unor factori de mediu și genetici necunoscuți sau necontrolați. În plus, protocolul experimental utilizat poate afecta drastic profilul COV. De exemplu, în lucrarea privind Aspergillus flavus, de Lucca et al. (2010) au detectat doar un singur terpene folosind SPME pentru a colecta substanțele volatile înainte de a le supune la GC-MS. Utilizând ulterior un concentrator de probe înainte de a le supune unui alt model de instrument GC-MS, grupul a reușit să distingă mai multe terpene (de Lucca et al., 2012). Metoda de manipulare a materialelor înainte de experimentare poate duce la apariția unor artefacte, iar autoclavarea poate determina formarea de substanțe volatile nebiogene (Börjesson et al., 1992). Având în vedere că datele sunt frecvent inconsecvente între teste, unii autori au pus la îndoială reproductibilitatea emisiilor microbiene de COV (Schleibinger et al., 2002). Lucrările viitoare cu COV fungici trebuie să fie conștiente de numeroșii factori care pot influența rezultatele. Ar fi util dacă ar fi elaborate orientări pentru cele mai bune practici de către comunitatea de oameni de știință care studiază COV fungici.
.