Analiza și cuantificarea fuziunii mioblastice in vitro cu ajutorul LADD Multiple Stain

Țesutul muscular scheletic adult conține o populație de celule precursoare, cunoscute sub numele de celule satelit, care sunt responsabile pentru repararea mușchiului scheletic (1-3). Celulele satelit activate (mioblaste) migrează la locul traumatismului muscular, unde proliferează, se diferențiază și fuzionează în miotuburi multinucleate (3-5). Succesul final al acestui proces este măsurat prin gradul în care mioblastele rezidente au fuzionat în timpul diferențierii terminale.

Pentru a evalua experimental fuziunea mioblastelor in vitro, se calculează un indice de fuziune bazat pe detectarea imunofluorescenței prin microscopie. Anticorpii marcați fluorescent sunt utilizați pentru a detecta proteinele structurale ale fibrelor musculare, cum ar fi lanțul greu al miozinei (MyHC) și desmina, sau, alternativ, se poate utiliza falloidina marcată fluorescent pentru a vizualiza F-actina (6-9). Nucleele sunt marcate fluorescent cu ajutorul unui compus care se leagă de ADN, cum ar fi Hoechst 33258. Ulterior, se calculează fie procentul de nuclei în miocite cu ≤3 nuclei (9), fie procentul de nuclei în miotuburi MyHC-pozitive (10). Aceste abordări sunt bine stabilite; cu toate acestea, ele necesită o optimizare amplă și consumatoare de timp pentru a genera un semnal puternic și specific pentru antigenul de interes și analiza ulterioară a fuziunii. În cazul în care se utilizează anticorpi marcați fluorescent, accesul la un microscop cu fluorescență este o cerință suplimentară care nu este disponibilă în toate instituțiile. Cuantificarea ulterioară necesită o analiză laborioasă și consumatoare de timp a numeroase câmpuri de vedere pentru a obține un indice de fuziune reprezentativ pentru populație. Aceste limitări, împreună cu cheltuiala relativă a testelor bazate pe anticorpi, ne-au determinat să dezvoltăm un test in vitro rapid și eficient din punct de vedere al costurilor pentru cuantificarea fuziunii mioblastelor, folosind pata multiplă LADD, disponibilă pe scară largă.

Patina multiplă LADD (11) este o pată nucleară și citoplasmatică combinată care conține fucsină și albastru de toluidină (Cat. #70955; LADD Research Industries, Williston, VT). Pentru studiile noastre, LADD proaspăt se prepară astfel încât să conțină 0,365 g de albastru de toluidină (Cat. #89640-5G; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) și 0,135 g de fuchsin (Cat. #47860-25G; Sigma-Aldrich) într-un volum final de 50 ml de etanol 30%. Soluția se amestecă până la dizolvare și apoi se filtrează prin hârtie de filtru Whatman (numărul 4) (Cat. #09-825B, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Colorantul LADD poate fi păstrat într-un recipient de plastic sau de sticlă la temperatura camerei și poate fi reutilizat. Celulele care urmează să fie colorate se spală cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și se fixează în etanol 70% timp de 10 minute. Se îndepărtează etanolul și se adaugă 500 µl de colorant LADD, asigurând acoperirea completă a celulelor. Celulele sunt incubate timp de 1 minut, după care se îndepărtează colorantul, iar celulele sunt spălate în mod repetat cu apă distilată până când LADD încetează să se infiltreze în apă. Celulele se lasă apoi să se usuce și se depozitează la temperatura camerei până la vizualizarea cu ajutorul microscopiei optice cu contrast de fază. Pentru a îmbunătăți iluminarea în timpul vizualizării, celulele colorate pot fi scufundate în PBS.

Pentru a determina dacă acest colorant poate fi utilizat cu succes pentru a vizualiza fuziunea mioblastică, celulele C2C12 au fost cultivate până la o confluență de 80 % (figura 1A) în condiții standard de cultură (12). Mediul a fost apoi schimbat în mediu de diferențiere care conține 2% ser de cal, ceea ce a dus la fuziunea în miotuburi (figura 1B). Diferențierea reușită a fost confirmată prin creșterea expresiei MyHC (figura 1D) în comparație cu celulele nediferențiate (figura 1C). În urma colorației LADD, mioblastele C2C12 nediferențiate prezintă o citoplasmă violet deschis și un nucleu mai închis (figura 1E; săgeată). Cu toate acestea, în urma diferențierii, citoplasma mioblastelor apare violet închis (figura 1F; vârfuri de săgeată), în timp ce nucleele mai deschise sunt clar vizibile în cadrul celulei multinucleate (figura 1F; săgeată). Prin urmare, în urma colorației multiple LADD, se observă nuclee clar definite și sunt la fel de ușor de distins din citoplasma miotubului multinucleat (Figura 1F), așa cum se observă cu ajutorul microscopiei cu fluorescență după imunocitochimie (Figura 1D).

Pentru a determina dacă analiza imaginilor poate fi utilizată pentru a măsura progresul fuziunii mioblastelor, celulele C2C12 au fost diferențiate timp de 6 zile, iar imaginile celulelor colorate cu LADD au fost luate la o mărire de 200× cu ajutorul unui microscop optic inversat Olympus CKX41 (Olympus Corporation, Tokyo, Japonia). După cum era de așteptat, numărul de miocite și miotuburi care fuzionează a crescut în mod clar la fiecare zi de diferențiere ulterioară (figura 2A). S-a calculat apoi un indice de fuziune și s-a observat că mioblaștii care se diferențiază își cresc incremental indicele de fuziune de la 0,45 % (Ziua 1) la 31,4 % (Ziua 6) (Figura 2B). Indicele de fuziune derivat în acest mod se compară favorabil cu indicele calculat utilizând imunocitochimia standard (pentru a detecta MyHC) și colorarea nucleară (13). Pentru a determina dacă software-ul de analiză ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) ar putea fi adaptat pentru a cuantifica suprafața miofibrelor (ca măsură a fuziunii), a fost dezvoltată și testată o macro pe imaginile reprezentate de Figura 2A. Macroul este configurat după cum urmează și apoi salvat:

• Deschideți ImageJ și faceți clic pe „Plugins = > Macros = > Startup Macros”

• Înlocuiți textul existent cu codificarea prezentată în Tabelul suplimentar S1.

Imaginile se deschid în ImageJ, iar macroul se execută făcând clic pe „Macros = > Run Macro”. Aceasta va analiza imaginile una câte una. Utilizatorul trebuie să confirme că pragul a fost setat corect; trebuie analizată doar zona miofibrei. Pragul de culoare poate fi modificat prin editarea liniei macro „setThreshold(0,130)”; prin creșterea celui de-al doilea număr, vor fi incluse mai multe zone ușor colorate, în timp ce mai multe zone sunt excluse atunci când acest număr este redus. Utilizând această metodă, suprafața miofibrelor a ajuns la 29,6 % în ziua 6 (figura 2C), comparându-se bine cu indicele de fuziune calculat pentru același moment (figura 2B). Coloranții Jenner și Giemsa pot fi, de asemenea, utilizați pentru a colora miotuburile pentru microscopia luminoasă în același mod ca și LADD, însă colorarea cu LADD este de multe ori mai rapidă, iar macroul ImageJ pe care l-am dezvoltat permite un control mai mare asupra zonelor care sunt măsurate (14).

Pentru a valida în continuare utilizarea colorantului multiplu LADD pentru analiza fuziunii, celulele C2C12 au fost diferențiate timp de 5 zile în prezența sau absența a 10 µM BB94 (Cat. #ab142087; Abcam, Cambridge, UK) și ulterior fixate și colorate cu LADD, așa cum s-a descris anterior. BB94 este un inhibitor sintetic de metaloprotează a matricei, disponibil în comerț, care s-a demonstrat anterior că reduce fuziunea mioblastelor (15,16). În prezența BB94, indicele de fuziune a scăzut semnificativ de la 50% (control DMSO) la 22% (P < 0,05) (Figura 2D); analiza suprafeței miofibrei a relevat aceeași tendință, fuziunea fiind redusă de la 46% (control DMSO) la 21% (P < 0,05).05) în prezența BB94 (Figura 2E).

Aici, prezentăm o metodă rapidă și nouă de colorare atât a structurii miofibrelor, cât și a mio-nucleilor asociați, folosind colorantul multiplu LADD. ImageJ este utilizat ulterior pentru a evalua cu precizie suprafața fibrelor musculare ca măsură a fuziunii. Costul relativ scăzut al LADD și timpul mult redus necesar pentru procesare și analiză înseamnă că fuziunea poate fi acum analizată rapid într-un laborator standard fără a fi nevoie de imunocitochimie și microscopie cu fluorescență.

.