Catalizatori de scindare a șirului de ADN la situsurile apurinice/aprimidinice

Compusul C1 poate scinda ADN-ul care conține situsul AP

Observația inițială care a sugerat prezența unei activități neobișnuite într-un subset de molecule mici studiate a fost făcută atunci când C1 (Fig. 1a) a fost testat ca inhibitor potențial al hOGG1. Mai exact, adăugarea acestui compus la reacțiile hOGG1 cu un oligodeoxinucleotid duplex oligodeoxinucleotid marcat fluorescent care conține un aduct 8-oxo-dG specific locului (Fig. 1b) a dus la obținerea unui produs suplimentar care a migrat mai repede decât produsul de β-eliminare; hOGG1 singur a dat numai produsul de β-eliminare (Fig. 1c). Nu au fost observate produse crestate atunci când ADN-ul care conține 8-oxo-dG a fost incubat cu C1 singur.

ADN-ul care conține situs AP a fost obținut prin tratarea ADN-ului corespunzător care conține dU cu UDG. (a) Structura unui catalizator reprezentativ pentru scindarea ADN-ului. (b) Substraturi de ADN. (c) Scindarea ADN-ului care conține 8-oxo-dG (250 nM) în prezența hOGG1 (100 nM) și C1 (10 μM). (d) Scindarea ADN-ului care conține situs AP (250 nM) în prezența hOGG1 (50 nM) și C1 (10 μM). (e) Scindarea ADN-ului care conține un situs AP (250 nM) în prezența hNEIL1 (50 nM) și C1 (10 μM). (f) Scindarea ADN-ului care conține un situs AP (2 μM) de către C1. Procentul de produse a fost corectat pentru scindarea spontană. Reacțiile au fost efectuate la 37 °C timp de 30 min (b-d) sau 16 h (e).

Au fost emise mai multe ipoteze mecaniciste care ar putea explica formarea noului produs. 1) În prezența C1, hOGG1 a dobândit capacitatea de a cataliza o reacție de δ-eliminare în plus față de funcțiile sale de glicozilază și β-eliminare AP lipază; 2) C1 ar putea converti produsul de β-eliminare în produsul de δ-eliminare; și 3) situsurile AP formate în reacția de glicozilază, ar putea servi ca substrat pentru o reacție de β,δ-eliminare catalizată de C1. Pentru a aborda aceste posibilități, s-a generat ADN duplex care conținea un singur situs AP specific situsului prin tratarea ADN-ului corespunzător care conține dU cu ADN-glicozilază de uracil (UDG) (Fig. 1b) și a reacționat cu C1 sau hOGG1, fie individual, fie în combinație. Ca și în cazul oligodeoxinucleotidului care conține 8-oxo-dG, hOGG1 a produs produsul de β-eliminare așteptat, în timp ce adăugarea de C1 a produs un amestec de doi produse (Fig. 1d). Acest amestec de produse s-a format, de asemenea, atunci când oligodeoxinucleotidul care conține AP a fost incubat doar cu C1. În timp ce poziția benzii de produs cu migrare mai lentă a corespuns produsului de β-eliminare a hOGG1 (Fig. 1d), banda de produs cu migrare mai rapidă a co-migrat cu produsul cunoscut de δ-eliminare a hNEIL1 (Fig. 1e). Astfel, C1 promovează reacțiile de β- și δ-eliminare la situsurile AP.

Reacția de scindare de către C1 pe ADN-ul care conține situsuri AP a fost dependentă de concentrație (Fig. 1e și Figura suplimentară S1), concentrațiile micromolare mici fiind suficiente pentru a observa produsele. Similar cu „nucleazele artificiale „26 concepute anterior, C1 a prezentat o cataliză turn-over pe substratul ADN: 1 pmol C1 a generat ~1,4 pmol de produse în 16 h (Fig. 1f). Astfel, rata de incizie de către C1 pe acest ADN a fost de ~1,5 × 10-3 min-1 sau mai mare. Comparația lui C1 cu reactivii AP lipazei disponibile în prezent, spermina17 și peptida KWKK23 , a demonstrat că catalizatorul nou-identificat a fost de cel puțin 100 de ori mai eficient (Figura suplimentară S1).

Câteva fracțiuni structurale din C1 sunt importante pentru cataliză

Analogi ai lui C1 au fost analizați pentru a determina contribuția unor caracteristici structurale specifice la chimia de scindare a catenei. Am examinat inițial capacitatea unor amine simple, disponibile în comerț, lipsite de fracțiunea indolinonă-pirrol C2 (Fig. 2) și CS1-CS3 (Figura suplimentară S2) de a inciza ADN-ul la un situs AP. Formarea de produse de incizie, dacă a existat, a fost sub nivelul de detectare la 10 μM. Astfel, fracțiunea indolinonă-pirrol este importantă pentru reacție. Este posibil ca subunitatea indolinonă-pirrol să se lege de situsul AP29 sau de canelura minoră și să poziționeze amina secundară pentru a cataliza scindarea șirului prin intermediul unui intermediar covalent cu situsul AP. Compușii C3 (fig. 2) și CS4 (figura suplimentară S2) care conțineau fracțiunea indolinonă-pirrolă, dar nu conțineau amina secundară, au fost, de asemenea, complet inactivi. Aceste date au sugerat puternic rolul aminei ca grup funcțional reactiv. Înlocuirea grupării metoxi de pe pirrol cu alte substituții, cum ar fi în C4 și C5 (Fig. 2), a dus la scăderea activității. Reacția a fost, de asemenea, modulată de un substituent pe grupa amino, astfel încât creșterea cerințelor sterice ale aminei secundare a scăzut cantitatea de produs observată [comparați C1, C6 și C7 (Fig. 2) și C4, CS5 și CS6 (Figura suplimentară S2)]. Aceste analize structură-activitate au demonstrat că mai multe dintre fracțiunile individuale sunt necesare, dar nu suficiente pentru scindare și că aceste fracțiuni trebuie să acționeze în mod cooperativ pentru a produce scindarea catenei.

(a) Structurile compușilor reprezentativi. (b) Substrat de ADN. (c) Testarea capacităților compușilor reprezentativi (10 μM) de a inciza ADN-ul care conține situsul AP (250 nM). Reacțiile au fost efectuate la 37 °C timp de 30 in.

Structura ADN-ului modulează scindarea catalizată de C1

Importanța fracțiunii indolinonă-pirrol pentru chimia de scindare a catenei a sugerat că structura substratului ADN ar putea afecta scindarea mediată de C1. Pentru a aborda aceste relații, vitezele inițiale de reacție au fost măsurate pentru un ADN monocatenar (secvența ca în Fig. 1a) și pentru ADN-urile bicatenare corespunzătoare care conțineau fie A, C, G, sau T vizavi de situsul AP. Oligodeoxinucleotidul homopolimeric, 5′-TAMRA-(T)5-AP-(T)11-3′, a fost, de asemenea, examinat ca o structură de ADN monocatenar lipsită de ambiguitate. Aceste date au demonstrat că, deși scindarea catenelor poate avea loc în contextul ADN monocatenar, ADN-urile bicatenare au fost substraturile mult preferate de C1 (Fig. 3). S-a constatat, de asemenea, că natura bazei opuse situsului AP a modulat cataliza, rata de hidroliză a situsului AP fiind mai rapidă în fața pirimidinelor decât a purinelor. Aceste observații sunt în concordanță cu propunerea conform căreia subunitatea indolinonă-pirrolă interacționează cu ADN-ul pentru a ocupa un spațiu gol la nivelul situsului AP. În special, rata inițială măsurată pentru ADN-ul bicatenar cu un C opus situsului AP, a fost foarte apropiată de rata observată pentru acest substrat în condiții de limitare a concentrației de C1 (Fig. 1f).

Reacțiile au fost efectuate la 37 °C folosind 250 nM ADN și 5 μM C1. Ratele inițiale medii cu abaterile standard respective au fost calculate din trei experimente independente utilizând software-ul KaleidaGraph 4.1 (Synergy Software). Valorile P au fost calculate folosind testul t al lui Students.

Cleavarea ADN-ului la situsurile AP de către C1 se realizează printr-un intermediar care implică amina secundară

Pentru a testa intermediarul covalent cu forma aldehidică deschisă în inel a deoxiribozei, o oligodeoxinucleotidă marcată cu 32P care conține situsul AP (Fig. 4a) a fost incubat cu C1 în prezența NaB(CN)H3. În timp ce acest reductor reacționează lent cu leziunea AP, acesta captează eficient conjugatul de ioni de imină sau iminiu. Într-o reacție de control cu oligodeoxinucleotidul care conține situsul AP și NaB(CN)H3 (Fig. 4b, banda 5), o mică fracțiune (~3%) din ADN a manifestat o mobilitate scăzută. Acest produs cu abundență scăzută este observat în mod obișnuit în reacțiile de captare23 și reprezintă probabil un complex cu molecule de Tris, așa cum s-a demonstrat anterior în reacțiile cu aductul ADN de malondialdehidă pirimidopurinonă30. Într-o reacție de control pozitiv care utilizează peptida lizină-triptofan-lizină-lizină (KWKK)23, intermediarul imină a fost captat, după cum reiese din deplasarea mobilității ADN-ului (Fig. 4b, banda 3). În prezența NaB(CN)H3 și C1, majoritatea ADN-ului (~80%) a format un complex care a apărut ca o specie cu mobilitate scăzută (Fig. 4b, banda 4). Formarea complexului nu s-a datorat legării nespecifice a C1 la ADN, deoarece nu s-a observat nicio deplasare atunci când oligodeoxinucleotidul corespunzător care conține dU a fost testat în condiții identice (Fig. 4b, banda 1). Aceste date au fost în concordanță cu ipoteza că reactivul a fost capabil să formeze un intermediar covalent de ioni de iminiu, care apoi poziționează o grupare laterală pentru o abstracție de protoni din inelul de zahăr.

(a) Substraturi de ADN. (b) Captarea cu cianoborohidridă a unui complex între C1 și ADN-ul care conține situsul AP. (c) Fragmentarea CID a ionului de iminiu intermediar redus. (d) Fragmentarea conjugatului C1-deoxiriboză redus după digestia enzimatică.

Pătrunderea reductivă a lui C1 a fost repetată folosind oligodeoxinucleotide care conțin situs AP nemarcate (Fig. 4a), iar produsul a fost analizat prin spectrometrie de masă (MS). Analiza a evidențiat o masă în concordanță cu complexul covalent ADN-C1 redus (m/z 1134,64 pentru -2). Disocierea indusă prin coliziune (CID) a acestui ion a avut ca rezultat un set complet de ioni a-B (bază) și w, în concordanță cu ionul de iminiu redus intermediar între C1 și situsul AP (Figura suplimentară S3). În seria de ioni a-B, fragmentarea legăturii C3′-O este, în mod normal, însoțită de pierderea neutră a nucleoazei. Legătura redusă dintre C1 și situsul AP era de așteptat să fie mai puțin labilă și, ca urmare, am observat ionul a4 (m/z 1330,1), precum și ionul a4-B (m/z 1005,6). Oligodeoxinucleotidul a fost, de asemenea, digerat enzimatic și analizat prin MS (Fig. 4c și Figura suplimentară S4). S-a observat un produs de digestie cu o masă în concordanță cu conjugatul C1-deoxiriboză redus (m/z 444,19); fragmentarea acestui ion produs a dat un ion fiică cu m/z 295,09, care a rezultat din pierderea neutră a N-metil amino-2-deoxiribitolului (Fig. 4d și figura suplimentară S4). Acest produs a fost identic cu cel preparat din reacția de aminare reductivă a 2-deoxiribozei și C1. Aceste studii demonstrează că C1 scindează ADN-ul care conține situs AP prin cataliză covalentă care implică amina secundară.

C1 crește stabilitatea termică a ADN-ului care conține un analog al unui situs AP

Efectul lui C1 a fost studiat asupra stabilității termice a ADN-ului care conține un analog structural al unui situs AP din tetrahidrofuran (THF), analog structural al unui situs AP care este incapabil de a suferi reacția de β-eliminare31. Tm a ADN-ului duplex care conține THF opus T (T:THF) a crescut cu 6,3 °C la adăugarea a 1 echivalent de C1, în timp ce Tm a ADN-ului de control care conține o pereche T:A a fost mai puțin afectată și a crescut doar cu 1 °C (Fig. 5). În timp ce curba de topire a T:THF cu C1 a indicat o stabilizare termică de către C1, prezența lui C1 a lărgit, de asemenea, curba de topire, indicând o tranziție de topire mai puțin cooperantă. În mod colectiv, aceste observații sugerează că C1 se leagă în mod specific de ADN la nivelul situsului AP, oferind o stabilizare localizată a helixului de ADN. Acest lucru este în concordanță cu modelul propus de interacțiuni între C1 și ADN, în care fracțiunea indolinonă-pirrol ocupă spațiul disponibil la nivelul situsului AP.

Curbele temperaturii de topire a T:A (a) și T:THF (b) au fost obținute folosind 5 μM ADN în tampon fosfat de sodiu 10 mM, pH 7.0, 100 mM NaCl și 1 mM EDTA în absența (linie continuă) și în prezența (linie punctată) a 5 μM C1.

C1 are o afinitate mai mare pentru ADN care conține un situs AP

Pentru a examina modul de legare și afinitatea de legare a C1 la ADN care conține situs AP, s-au efectuat analize de dicroism circular (CD) folosind oligodeoxinucleotide duplex T:A care conțin THF și de control (Fig. 6). CD indusă (ICD) a C1 în urma interacțiunii cu duplexul T:THF a fost observată ca un semnal excitonic puternic, o formă bisignată cu benzi pozitive și negative în raport cu maximul de absorbție al C1 liber. Acest lucru indică, în general, formarea unor complecși dimerici sau de ordin superior, fie într-un mod de legare la nivelul canelurilor, fie într-un mod de legare prin stivuire externă32. Titrarea lui C1 cu concentrații crescânde de T:THF (Fig. 6a și Figura suplimentară S5) a evidențiat atât interacțiuni nespecifice, cât și specifice. La începutul titrării, C1 este în exces și sunt favorizate interacțiunile nespecifice. La adăugarea de T:THF, ICD la ~488 nm a crescut. La o concentrație de ADN de aproximativ 2 μM, banda ICD s-a deplasat la o energie mai mică (~495 nm) și apoi a scăzut până la punctul de echivalență și s-a stabilizat în exces de ADN, indicând o interacțiune specifică. Titrarea C1 cu ADN T:A de control (Fig. 6a și figura suplimentară S5) nu a prezentat ICD pozitiv în jurul valorii de 495 nm, indicând absența interacțiunilor specifice. Titrarea directă a T:THF a prezentat, de asemenea, dovezi de interacțiuni nespecifice și specifice (Fig. 6b). La concentrații scăzute de C1 cu ADN în exces, banda ICD a fost centrată la ~495 nm (specifică); pe măsură ce concentrația de C1 a crescut în raport cu ADN, intensitatea ICD a crescut și s-a deplasat către o energie mai mare (~488 nm), indicând o legare nespecifică, așa cum era de așteptat la concentrații mari de ligand. Deplasarea hipocromică observată poate indica o schimbare sau o conformație mai definită a C1 atunci când este legat în mod specific la situsul AP. Titrarea ADN-ului de control fără un situs AP a arătat, de asemenea, un ICD și dovezi de legare nespecifică (Fig. 6c). Este demn de remarcat faptul că banda de la 450-520 nm a apărut doar la un exces de 3 ori mai mare de C1 în raport cu ADN-ul, ceea ce face ca acest interval de lungimi de undă să fie cea mai bună alegere pentru a construi curbele de legare. Izotermele de legare au fost construite și analizate cu ajutorul unui model simplu de legare bimoleculară, așa cum a fost publicat anterior32. Ecuațiile neliniare care au rezultat din izotermele de 500 nm (Fig. 6d) au dat o constantă de disociere (KD) de 64 μM pentru ADN T:A de control (legare nespecifică) și de 29 μM pentru ADN T:THF (legare specifică); KD a lui C1 cu duplexul care conține THF a fost calculată ca fiind de 22 μM după o scădere pentru a corecta contribuția de legare nespecifică și posibilele interacțiuni ligand-ligand (Tabelul 1). Valorile KD calculate la 495 nm au fost doar puțin în afara erorilor celor calculate la 500 nm (tabelul 1).

(a) Curbe de titrare a intensității ICD la 500 nm folosind o concentrație constantă de C1 (20 μM) și concentrații crescânde de ADN (titrare inversă). (b) Spectre CD pentru T:THF și (c) T:A folosind o concentrație constantă de ADN (10 μM) și concentrații crescânde de C1 (titrare înainte). (d) Curbe de titrare a intensității ICD la 500 nm în funcție de logaritmul concentrației C1 pentru T:THF și T:A (derivate din datele din panourile b și c). (e) Curbe de titrare a intensității ICD la 500 nm în funcție de logaritmul concentrației C6 pentru T:THF și T:A (derivate din datele din figura suplimentară S6). (d) Curbe de titrare a intensității ICD la 500 nm în funcție de logaritmul concentrației C6 pentru T:AP și T:A (derivate din datele din figura suplimentară S6).

În plus, a fost luată în considerare posibilitatea ca afinitatea lui C1 să fie diferită pentru ADN care conține un situs AP natural în loc de THF. Pentru a răspunde la această întrebare, am testat compusul C6 (Fig. 2), înrudit structural, dar inactiv, în analize CD cu ADN care conține fie THF, fie un situs AP care a fost creat din dU prin tratament cu UDG. Spectrele CD observate pentru C6 în experimentele de titrare înainte folosind ADN-urile T:THF și T:A (Figura suplimentară S6) au fost în general similare cu cele observate pentru C1 (Fig. 6b,c). Izotermele de legare au fost construite (Fig. 6e) și analizate ca mai sus. KD a C6 cu duplexul care conține THF, corectată pentru interacțiunile nespecifice, a fost calculată ca fiind de 28 μM (tabelul 1), care este cu doar ~25% mai mare decât KD corespunzătoare calculată pentru C1. Astfel, C6 pare a fi un model adecvat pentru studierea interacțiunilor lui C1 cu ADN-ul. Titrarea înainte a C6 a fost apoi efectuată folosind ADN care conținea situsul AP derivat din UDG (Figura suplimentară S6). Analizele izotermelor de legare au arătat că afinitatea lui C6 față de acest ADN a fost în esență identică cu cea a ADN-ului care conține THF (Fig. 6f și Tabelul 1). Având în vedere că deoxiriboza la un situs AP natural există în mod predominant în forma închisă în inel, asemănătoare THF31 , acest din urmă rezultat nu a fost surprinzător. Se poate anticipa faptul că, înainte de formarea unui intermediar covalent, afinitatea lui C1 față de ADN-ul care conține situsul AP ar fi comparabilă cu cea măsurată pentru ADN-ul care conține THF. Astfel, legarea mai puternică a C1 la ADN care conține un situs AP în comparație cu ADN-ul de control a fost în concordanță cu datele privind stabilitatea termică și, împreună, susține propunerea că subunitatea indolinonă-pirrol ocupă un spațiu gol la situsul AP al ADN-ului. Este probabil că afinitatea lui C1 pentru situsul AP contribuie la activitatea sa de liază și oferă un avantaj clar față de C2, CS1, CS2 și CS3, care nu au fracțiunea indolinonă-pirrol (Fig. 2 și Figura suplimentară S2).

Concluzii

Catalizatorii de scindare a catenei AP a ADN-ului descriși în acest studiu reprezintă o nouă clasă de compuși care pot fi utilizați pentru a scinda situsurile AP în condiții fiziologice. Pe baza acestei structuri de bază, moleculele pot fi proiectate pentru a îmbunătăți selectivitatea inciziei situsului AP vizavi de diferite baze și, potențial, pentru diferite contexte de secvență. Datorită progreselor recente în dezvoltarea tehnicilor de screening de mare randament, acești compuși ar putea fi rapid avansați pentru a deveni reactivi eficienți pentru a tăia situsurile AP care sunt create prin depurinare sau prin calea BER în celule și organisme. Versiunile optimizate ale C1 ar putea avea, de asemenea, aplicații terapeutice, în special în combinație cu multe medicamente anticancerigene comune care fie deteriorează ADN-ul, cum ar fi agenții alchilanți33 , fie vizează repararea ADN-ului, cum ar fi inhibitorii PARP34,35 sau AP endonucleazei36 . Este demn de menționat faptul că capetele 3′ create prin β- sau β,δ-eliminare nu pot fi utilizate de ADN polimerazele fără o reparație prealabilă37. Se așteaptă ca consecințele biologice ale conversiei situsurilor AP în astfel de rupturi de șir de ADN să fie complexe și să varieze în funcție de capacitatea celulară de a repara sau de a tolera diferite tipuri de leziuni ale ADN-ului. Rezultatele posibile pot include o eficacitate terapeutică crescută a tratamentelor anticancerigene (distrugerea mai eficientă a celulelor) și o diminuare a mutagenezei induse de medicamente. Clivarea ADN-ului în locurile AP poate fi deosebit de benefică pentru tratamentul cancerelor care prezintă defecte în mecanismele de reparare a rupturilor de șir de ADN, cum ar fi cancerele cu deficiențe BRCA34,35.

.