Účinná biotinylace a jednokroková purifikace značených transkripčních faktorů v savčích buňkách a transgenních myších

Výsledky

Účinná biotinylace značeného GATA-1 v transfekovaných buňkách. Schéma specifické biotinylace značených proteinů in vivo v savčích buňkách je uvedeno na obr. 1A. Podle tohoto postupu je malá (23 aa) peptidová značka fúzována se zájmovým proteinem a koexprimována v buňkách společně s BirA, bakteriální protein-biotin ligázou (20). Použitá peptidová značka byla dříve izolována ze syntetické peptidové knihovny, která byla prověřena na biotinylaci zprostředkovanou BirA, k níž dochází specificky na lysinovém zbytku značky (16). Vyhledávání v databázích proteinů neidentifikovalo žádné přirozeně se vyskytující proteiny, které by měly podobný sekvenční motiv jako peptidová značka

Proteinem, který jsme při testování tohoto systému označili, byl základní myší hematopoetický transkripční faktor GATA-1 (přehled viz ref. 25). Značka byla fúzována N-terminálně s GATA-1 a exprimována pod kontrolou lidské β-globinové expresní kazety v buňkách MEL, které lze indukovat k terminální diferenciaci erytroidních buněk (22). BirA byla rovněž klonována a exprimována v buňkách MEL pomocí lidské globinové expresní kazety. Byly izolovány klony odpovídající jednoduchým a dvojitým stabilním transfektantům pro značený GATA-1 a BirA a zpočátku byly testovány na expresi obou konstruktů. V případě GATA-1 detekovala Western blot analýza pomocí protilátky proti GATA-1 pomaleji migrující značený protein i endogenní GATA-1 v jaderných extraktech z transfekovaných buněk (obr. 1B, dráhy 1 a 2). Exprese BirA byla analyzována na úrovni RNA (údaje nejsou uvedeny).

Na vybraných stabilních transfektantech jsme dále testovali, zda je značený protein GATA-1 biotinylován BirA. Testování jaderných extraktů z buněčných klonů MEL pomocí konjugátu streptavidin-HRP ukázalo silný signál odpovídající značenému proteinu GATA-1, detekovatelný pouze v pruhu značeného dvojitého transfektantu GATA-1/BirA (obr. 1B, pruh 5). V nepřítomnosti BirA není biotinylace značeného GATA-1 patrná (obr. 1B, pruh 6). Tato zjištění potvrzují, že protein BirA je v transfekovaných buňkách MEL syntetizován v aktivní formě. Kromě toho je v jaderných extraktech buněk MEL exprimujících pouze BirA pozorována velmi malá nespecifická biotinylace na pozadí (obr. 1B, pruh 7). Proto jsme dospěli k závěru, že exprese bakteriální BirA protein-biotin ligázy v buňkách MEL může specificky biotinylovávat savčí transkripční faktor nesoucí unikátní peptidovou značku.

Dále jsme testovali účinnost biotinylace navázáním značeného GATA-1 v surových jaderných extraktech na streptavidinové paramagnetické kuličky Dynabeads (obr. 1C). Analýza materiálu eluovaného z kuliček ukázala, že byl navázán téměř veškerý značený protein GATA-1 (porovnejte pruh 2 s pruhy 1 a 3, obr. 1C). Opakované použití stejného filtru se streptavidinem-HRP ukazuje ≈100% účinnost biotinylace a zachycení značeného GATA-1 kuličkami (obr. 1C, pruhy 4 a 5). Kromě toho, v souladu s tím, co bylo pozorováno na obr. 1B, dochází k malé vazbě endogenně biotinylovaných proteinů na pozadí kuliček, jak bylo zjištěno pomocí streptavidinu-HRP (obr. 1C, dráha 5). Tato data ukazují, že značený GATA-1 je velmi účinně biotinylován a získáván z extraktů vazbou streptavidinu se zanedbatelným biotinylováním na pozadí.

Purifikace biotinylovaného GATA-1 ze surových jaderných extraktů vazbou streptavidinu v jednom kroku. Zkoumali jsme také proveditelnost jednokrokové purifikace při izolaci biotinylovaného GATA-1 ze surových jaderných extraktů přímou vazbou na streptavidinové kuličky při mírné přísnosti (150 mM NaCl/0,3% Nonidet P-40/200 ng/μl kuřecího sérového albuminu). Nejprve jsme vyzkoušeli kontrolní vazbu z 5 mg surových jaderných extraktů z buněk MEL exprimujících pouze BirA (obr. 2, dráha 4). Eluovaný materiál se skládal z přibližně pěti silně zbarvených pásů na pozadí mnohem slabších pásů (obr. 2, pruh 5). Vázané proteiny v pozadí jsme identifikovali vyříznutím celého pruhu z gelu a jeho analýzou pomocí kapalinové chromatografie-tandemové MS. Takto identifikované proteiny jsou v tabulce 1 rozděleny podle biologické funkce a buněčného kompartmentu, jak je definuje Gene Ontology Consortium (www.geneontology.org). Výsledky ukázaly, že nejhojnějšími identifikovanými proteiny v pozadí byly přirozeně biotinylované karboxylázy a přidružené enzymy, které se do značné míry shodovaly s intenzivně se barvícími pásy. Zjistili jsme také vazbu na pozadí hojně zastoupených jaderných proteinů podílejících se na zpracování mRNA, jako jsou sestřihové faktory, a také ribozomálních proteinů. Tyto tři třídy proteinů dohromady tvořily >80 % vazby pozadí za použitých podmínek (tabulka 1). Je pozoruhodné, že bylo identifikováno velmi málo peptidů odpovídajících faktorům zapojeným do regulace transkripce (tabulka 1). Došli jsme k závěru, že vazba pozadí na streptavidinové kuličky je způsobena především endogenními biotinylovanými proteiny a také hojnými jadernými faktory zapojenými do zpracování mRNA a syntézy a sestavování ribozomů, přičemž nespecifická vazba faktorů zapojených do regulace/aktivace transkripce je velmi malá.

Dále jsme zkusili navázat podobné množství surového jaderného extraktu (5 mg) ze značených dvojitých transfektantů GATA-1/BirA za stejných podmínek (obr. 2, pruh 2). Vzor zbarvení pruhu s eluovaným materiálem (obr. 2, pruh 3) se výrazně lišil od vzoru pozorovaného při vazbě pozadí v pruhu 5, což naznačuje významné obohacení proteinů koelujících se značeným GATA-1 (obr. 2, pruh 3 vs. pruh 5). Biotinylovaný GATA-1 a koelující proteiny se mohou zředit nebo soutěžit o vazbu s nespecifickými proteiny pozorovanými v pruhu 5. Obohacení proteinů viditelné v pruhu 3 tak může odpovídat kopurifikovaným proteinům interagujícím s GATA-1. V eluovaném materiálu jsme také pozorovali silně zbarvený migrující pás s velikostí podobnou té, která se očekává pro značený GATA-1 (obr. 2, šipka, pás 3). Přítomnost GATA-1 v tomto pásu jsme potvrdili excizí gelu a MS. Podrobná analýza všech proteinů kopírujících značený GATA-1 bude publikována na jiném místě (P.R., F.G. a J.S., nepublikované výsledky). Celkově tato data prokazují kvantitativní biotinylaci značeného GATA-1 v buňkách MEL a jeho účinnou purifikaci ze surových proteinových extraktů jednostupňovým postupem přímou vazbou na streptavidinové kuličky s několika vazebnými pásy v pozadí, které odpovídají především endogenně biotinylovaným proteinům a snadno identifikovatelným hojným jaderným/jaderným proteinům.

Biotinylace neovlivňuje interakční vlastnosti GATA-1 s proteiny ani s DNA. Protože je možné, že přidání peptidové značky a/nebo biotinylace může ovlivnit vlastnosti značeného proteinu, testovali jsme, zda biotinylovaný GATA-1 může stále podstupovat protein-proteinové interakce se známým partnerem GATA-1, jako je FOG-1 (26), a zda se může in vivo vázat na známé cíle genu GATA-1, jako je promotor myšího globinu βmaj. Provedli jsme pull-down experiment biotinylovaného GATA-1 navázáním jaderných extraktů na streptavidinové kuličky a testovali jsme, zda je FOG-1 také kopurifikován. Zjistili jsme, že FOG-1 byl stažen z extraktů exprimujících biotinylovaný GATA-1, ale ne z extraktů exprimujících pouze BirA (obr. 3A, dráhy 2 a 4). Pomocí MS jsme také zjistili, že FOG-1 kopuruje s biotinylovaným GATA-1. Provedli jsme také experiment s vytažením chromatinu (ChIP), při kterém byl sonikovaný chromatin z formaldehydem zesíťovaných buněk MEL inkubován s kuličkami streptavidinu, následovala eluce navázaného materiálu a obnovení vytažené DNA. Při použití primerů specifických pro promotor βmaj jsme zjistili obohacení o tyto sekvence v DNA stažené z chromatinu buněk exprimujících biotinylovaný GATA-1, ale ne z buněk exprimujících BirA (obr. 3B). Zjistili jsme také, že biotinylace neovlivňuje subjaderné rozložení, které je u GATA-1 běžně pozorováno (obr. 5, který je zveřejněn jako podpůrná informace na webových stránkách PNAS; cit.27 ), a že biotinylovaný GATA-1 vykazuje identický biochemický frakcionační profil jako endogenní GATA-1 v jaderných extraktech buněk MEL (údaje nejsou uvedeny). Celkově tyto výsledky poskytují přesvědčivý důkaz, že vlastnosti GATA-1 nejsou biotinylační značkou ovlivněny. Kromě toho tato data také ukazují použití biotinylačního značení jako alternativy k protilátkám v metodách zahrnujících afinitní purifikační krok, jako je např. pull-downs proteinů nebo ChIP test.

Biotinylační značení u transgenních myší. Možnost přímé izolace biotinem značeného proteinu ze surových extraktů v jediném kroku zvyšuje perspektivu využití tohoto přístupu při purifikaci značených proteinů z limitních zdrojů, jako jsou myší tkáně. Proto jsme testovali, zda bude značení biotinylací zprostředkované BirA fungovat také in vivo u transgenních myší. Protože nadměrná exprese GATA-1 vede u myší k embryonální letalitě (28), otestovali jsme tento přístup značením esenciálního erytropoetického transkripčního faktoru EKLF (29). Myší cDNA EKLF byla označena biotinylační značkou a dvojitým hemaglutininovým epitopem a mikroinjektována do myších vajíček za účelem vytvoření transgenních myších linií. Podobně byly založeny transgenní myší linie také mikroinjekcí konstruktu BirA/erytroidní expresní kazety. Byly vybrány a zkříženy transgenní myší linie s detekovatelnou expresí značeného EKLF a BirA v erytroidních buňkách. In vivo byla hodnocena biotinylace značeného EKLF v jaderných extraktech připravených z fetálních jater 13,5denních postkoitálních embryí. Western blot analýza s protilátkou proti EKLF detekovala endogenní EKLF i značený EKLF, který byl vizualizován jako dublet (obr. 4, pruh 1). Vazba jaderných extraktů z fetálních jater na streptavidinové kuličky ukazuje, že se zachová pouze horní pás v dubletu, což naznačuje, že je biotinylovaný (obr. 4, dráhy 2 a 3). Toto pozorování je potvrzeno sondováním stejného blotu streptavidinem-HRP, který detekuje pouze jeden pás (obr. 4, dráhy 7 a 9). Doublet detekovaný protilátkou EKLF je s největší pravděpodobností způsoben rozdílným využitím iniciačních kodonů translace na N-terminálně fúzované biotinylační značce (horní pás) a na dvojitém epitopu hemaglutininu přítomném bezprostředně za ním, který rovněž obsahuje iniciační kodon (dolní pás). V důsledku toho slouží jako substrát pro BirA pouze horní pás nesoucí biotinylační značku, což dále prokazuje specifičnost tohoto přístupu in vivo. Vazba jaderných extraktů na streptavidinové kuličky také ukázala, že významný podíl (≈50 %) značeného EKLF je biotinylován ve fetálních játrech transgenních myší. Předpokládáme, že rozdíl v účinnosti biotinylace mezi transfekovanými buňkami a fetálními játry (kromě použití různých fúzních proteinů) může odrážet omezení dostupnosti biotinu in vivo (biotin je hojně obsažen v FCS používaném k doplnění médií buněčných kultur) nebo rozdíl v úrovni exprese BirA. Tyto výsledky ukazují, že specifické biotinylace značeného EKLF bakteriální BirA lze s vysokou účinností dosáhnout i in vivo u transgenních myší.

.