Izolace a identifikace těkavých látek
Lidský nos vnímá mnoho těkavých organických látek jako pachy a tyto pachy jsou často první známkou přítomnosti plísní. Chemická charakterizace (izolace, separace, identifikace a kvantifikace) těkavých organických látek však vyžaduje specializované analytické metody, odlišné od přístupů používaných v tradiční „mokré“ chemii. Technologický pokrok na konci 20. a počátku 21. století zlepšil naši schopnost detekovat těkavé látky přesně, precizně a v nízkých koncentracích (Zhang a Li, 2010; Hung et al., 2015). Stručně řečeno, tradiční metody zahrnují destilaci s vodní parou a extrakci kapalina-kapalina, po níž následuje koncentrace a chemické ověření jednotlivých sloučenin. Některé z prvních studií chemické povahy těkavých organických látek byly provedeny pomocí methylenchloridových extraktů, které byly zahuštěny destilací s vodní parou a analyzovány pomocí chromatografie plyn-kapalina a hmotnostní spektrometrie (MS). V jedné z prvních studií využívajících tento přístup byly analyzovány těkavé organické látky Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus oryzae a Aspergillus parasiticus. Všechny čtyři druhy produkovaly 3-methylbutanol, 3-oktanon, 3-oktanol, 1-okten-3-ol, 1-oktenol a 2-okten-1-ol. U A. niger tvořil více než 90 % identifikované směsi těkavých organických látek 1-okten-3-ol, což je pachová sloučenina, která dodává houbám jejich charakteristickou vůni. U A. parasiticus tvořil 1-okten-3-ol 35,6 % celkové směsi těkavých látek, zatímco příbuzná osmiuhlíkatá sloučenina 2-okten-1-ol, která má nepříjemný zápach po hořčici a oleji, představovala 34,8 % (Kamiński et al., 1974).
Metody se od té doby opírají o plynovou chromatografii s hmotnostní spektrometrií (GC-MS), která kombinuje chromatografickou separaci, identifikaci pomocí hmotnostních spekter a chromatografické retence a kvantifikaci těkavých vzorků. Těkavé organické látky v hlavovém prostoru houbových kultur se obvykle zachycují pomocí pevných sorpčních materiálů, jako je aktivní uhlí nebo vlákno. Každá metoda sběru má vrozené zkreslení a může umožnit vznik artefaktů; obecně se přednostně sbírají nepolární sloučeniny před polárními. Plynová chromatografie může také přinášet chyby v tom, že je někdy obtížné oddělit dvě sloučeniny od sebe, což vede k jejich záměně. To bylo zaznamenáno v případě 2-methyl-1-butanolu a 3-methyl-1-butanolu, izomerů, které se liší pouze transpozicí jedné methylové skupiny (Börjesson et al., 1992). Mezi další nevýhody analýzy GC-MS patří potřeba kvalifikované obsluhy, její relativní nákladnost a skutečnost, že není účinná u reaktivnějších těkavých organických látek (Elke et al., 1999; Gao et al., 2002; Gao a Martin, 2002; Rappert a Müller, 2005).
Mikroextrakce na pevné fázi (SPME) je populární a přenosná metoda. VOC jsou nejprve absorbovány a koncentrovány na vlákně a později dopraveny do detektoru, kde dochází k desorpci v samotném GC injektoru. SPME se dobře hodí pro odběr vzorků z životního prostředí, které se pak dopravují zpět do laboratoře k identifikaci. Ve spojení s GC-MS je vhodným a široce používaným prostředkem pro kvalitativní identifikaci těkavých organických látek z mikrobiálních kultur nebo z kontaminovaných budov (Fiedler et al., 2001; Wady et al., 2003; Jeleń a Grabarkiewicz-Szczesna, 2005). SPME je často nejlepším přístupem pro stanovení relativního množství cílové těkavé sloučeniny v průzkumné situaci nebo pro opakované procesy vzorkování. Není však užitečná pro identifikaci nových sloučenin.
Bylo vyvinuto mnoho specializovaných analytických metod, které doplňují klasické přístupy GC-MS a mohou být užitečné pro cílené analýzy. Například protonová přenosová reakce-hmotnostní spektrometrie (PTR-MS) je užitečná pro rychlý odběr vzorků a pro detekci nízkých koncentrací (Kamysek et al., 2011; Schwoebel et al., 2011). Tato metoda se používá v environmentálních vědách, potravinářské technologii a lékařské diagnostice (Gasperi et al., 2001; Cappellin et al.,
Pomocí termální desorpce (TD)-plynové chromatografie/hmotnostní spektroskopie byl charakterizován profil těkavých metabolitů Aspergillus fumigatus in vitro, který ukazuje na charakteristický podpis obsahující monoterpeny kamfen, α- a β-pinen a limonen; a seskviterpenové sloučeniny α- a β-trans-bergamoten (Koo et al..), 2014).
Výběrová iontová průtoková trubicová hmotnostní spektrometrie (SIFT-MS) má schopnost rychle a citlivě detekovat mikrobiální těkavé organické látky ve středně složité směsi plynů. Je schopna zaměřit se na těkavé organické látky v nízkých koncentracích částic na miliardu a může měřit některé sloučeniny v rozsahu částic na bilion. Při této technice jsou celkové VOC ionizovány v průtokové trubici a nevyžadují chromatografickou separaci (Syhre et al., 2008; Chambers et al., 2011). Metoda byla použita ke kvantifikaci těkavých organických látek emitovaných A. fumigatus v kokultuře s bakteriemi, které se často vyskytují v nemocných lidských plicích. Kultury s A. fumigatus produkovaly „velké“ množství amoniaku a organosirných sloučenin methanethiolu (známého také jako methylmerkaptan), dimethylsulfidu a dimethyldisulfidu (Chippendale et al., 2014).
Simultánní destilační extrakce (SDE) zahrnuje krátké křemenné vlákno pokryté organickým materiálem jako stacionární fázi pro koncentraci těkavých organických látek, které jsou poté desorbovány v horkém injektoru. SDE se používá pro stanovení těkavých složek v environmentálních, potravinářských, forenzních, ropných, farmaceutických a polymerních analýzách s cílem získat koncentrovanější vzorky (Orav et al., 1996). Například některé aromatické sloučeniny byly studovány pomocí kombinace SDE a SPME. Chuťové sloučeniny lze analyzovat kvantitativně pomocí SDE, zatímco SPME se používá pro jednoduchý, rychlý a rutinní screening (Cai et al., 2001).
Multikapilární sloupcový iontově mobilní spektrometr (MCC-IMS) má citlivost v rozsahu částic na bilion, je vysokorychlostní a vyžaduje nízké technické znalosti. Tímto přístupem byly v analýze prostoru hlavy rozlišeny charakteristické metabolity druhů A. fumigatus a Candida (Perl et al., 2011).
Elektronické nosy (e-nosy) převádějí těkavé látky na elektrické signály na základě interakce s elektronickými povrchy a lze je použít k detekci známých sloučenin. E-nosy se skládají ze skupiny chemických senzorů s různou selektivitou, jednotky pro předběžné zpracování signálu a systému pro rozlišování vzorů (Gardner a Bartlett, 1994). Různé těkavé organické látky tvoří charakteristický otisk prstu, který lze rozlišit porovnáním s dříve zaznamenanými vzory v rozpoznávacím systému. Lékařské aplikace elektronických nosů se původně zaměřovaly na bakteriální patogeny nebo neinfekční onemocnění, jako je rakovina plic, chronická obstrukční plicní nemoc a astma (Valera a kol., 2012). V závislosti na aplikaci se pro diagnostické účely používají vzorky těkavých organických látek z výtěrů, sputa, séra, výkalů, dechu nebo moči. Vzorky dechu byly použity pro včasnou detekci aspergilózy (de Heer et al., 2013).
Při práci s těkavými organickými sloučeninami hub zůstává mnoho technických problémů a často je obtížné porovnávat výsledky získané mezi různými laboratořemi. Stejné druhy hub mohou mít různé profily VOC na základě neznámých nebo nekontrolovaných environmentálních a genetických faktorů. Kromě toho může použitý experimentální protokol výrazně ovlivnit profil VOC. Například v práci o Aspergillus flavus de Lucca et al. (2010) zjistili pouze jeden terpen při použití SPME ke sběru těkavých látek před jejich podrobením GC-MS. Později při použití koncentrátoru vzorků před podrobením jinému modelu přístroje GC-MS byla skupina schopna rozeznat několik terpenů (de Lucca et al., 2012). Způsob manipulace s materiály před experimentem může vést ke vzniku artefaktů a autoklávování může způsobit vznik nebiogenních těkavých látek (Börjesson et al., 1992). Vzhledem k tomu, že údaje jsou v rámci pokusů často nekonzistentní, někteří autoři zpochybňují reprodukovatelnost mikrobiálních emisí VOC (Schleibinger et al., 2002). Při budoucí práci s houbovými VOC je třeba brát v úvahu mnoho faktorů, které mohou ovlivnit výsledky. Bylo by užitečné, kdyby komunita vědců, kteří studují houbové VOC, vypracovala pokyny pro osvědčené postupy
.