10x Genomics Blog

Plavba v moři buněk:

Komplexní biologické systémy jsou výsledkem koordinované funkce jednotlivých buněk, které předvádějí složitý „tanec“, přičemž každá z nich přispívá do souboru svou vlastní zvláštní rolí. Kvůli této složitosti je výzkum genové exprese v organismech, tkáních nebo buněčných populacích často omezen použitím tradičních metod hromadného vyhledávání RNA. Jako vědci intuitivně chápeme, že když „rozmělníme a najdeme“, abychom provedli experimenty na naší naředěné směsi RNA, získáme ve skutečnosti jen malou představu o tom, co by se mohlo dít v buňkách našeho zájmu: rozdíly mezi jednotlivými buňkami jsou přehlédnuty a buněčná heterogenita může být zcela zamaskována. Ve skutečnosti analýza exprese objemové RNA často popisuje předpokládaný stav, ve kterém ve skutečnosti neexistuje žádná (nebo jen velmi málo) buněk!

Možná jste neurovědec, pracujete v myším mozku a studujete vývoj subpopulace neuronů, které produkují specifický neurotransmiter. Kdybyste mohli tuto populaci izolovat a analyzovat ji buňku po buňce, potenciální poznatky by byly vskutku neuronálně stimulující! Podobně je tomu v případě výzkumu rakoviny: jak nejlépe oddělit genovou expresi a, což je možná ještě důležitější, buněčnou heterogenitu v nádoru? Co kdybyste mohli porovnávat nejen rozdíly mezi nádory, ale i uvnitř nádoru a zkoumat populace imunitních buněk související s nádorovým mikroprostředím? Tuto rozmanitost, často zastřenou metodami hromadné RNA-seq, lze odhalit pomocí jednobuněčné RNA-seq, která specificky zkoumá tyto klinicky významné buněčné populace. Příkladů nevýhod objemové analýzy je mnoho a pitvání rozdílů buněčných typů ve většině, ne-li ve všech těchto složitých biologických systémech je zásadní pro naše pochopení jejich přínosu, zejména během vývoje a při progresi onemocnění.

Jak izolovat a analyzovat jednotlivé buňky?

Technologie scRNA-seq (single-cell RNA-seq) společnosti 10x Genomics, Chromium™ Single Cell 3′ Solution, umožňuje analyzovat transkriptomy po jednotlivých buňkách pomocí mikrofluidního dělení pro zachycení jednotlivých buněk a přípravu knihoven cDNA s čárovým kódem pro sekvenování nové generace (NGS). Konkrétně se jednotlivé buňky, činidla pro reverzní transkripci (RT), gelové kuličky obsahující oligonukleotidy s čárovým kódem a olej kombinují na mikrofluidním čipu a vytvářejí reakční vezikuly nazývané gelové kuličky v emulzi neboli GEM. GEM se vytvářejí paralelně v mikrofluidních kanálech čipu, což uživateli umožňuje zpracovat 100 až 10 000 jednotlivých buněk během jediného 7minutového běhu Chromium™ Instrument. Je důležité si uvědomit, že buňky jsou vkládány v limitním ředění, aby se maximalizoval počet GEM obsahujících jednu buňku a zajistil se tak nízký počet doubletů při zachování vysoké míry výtěžnosti buněk až ~65 %.

Každý funkční GEM obsahuje jednu buňku, jednu gelovou kuličku a RT činidla. V každém reakčním váčku GEM se lyzuje jedna buňka, Gel Bead se rozpustí, aby se do roztoku uvolnily identicky čárově kódované RT oligonukleotidy, a dojde k reverzní transkripci polyadenylované mRNA. Výsledkem je, že všechny cDNA z jedné buňky mají stejný čárový kód, což umožňuje mapování sekvenačních čtení zpět k původním jednotlivým buňkám původu. Příprava knihoven NGS z těchto cDNA s čárovým kódem se pak provádí ve vysoce účinné hromadné reakci. Níže uvedené video skvěle názorně vysvětluje, jak to všechno funguje.

Od přípravy vzorků až po videa s návody:

Pracovní postup Chromium Single Cell 3′ začíná s vašimi buňkami, po kterých následuje konstrukce knihovny NGS pomocí našich souprav činidel a kontroléru Chromium. Příprava knihovny cDNA s čárovým kódem (jak je obecně popsáno ve výše uvedeném videu) je důležitým krokem a v souladu s příslovím „odpadky dovnitř, odpadky ven“ – příprava vysoce kvalitních buněčných suspenzí je klíčem k získání co největšího množství nebo vašich dat RNA-seq. Pokud potřebujete pomoci s procesem přípravy buněk, máme na našich webových stránkách k dispozici několik demonstrovaných protokolů, jako je disociace nervové tkáně nebo příprava suspenzí mechových protoplastů pro použití v scRNA-seq, přičemž další protokoly pravidelně přidáváme na naše webové stránky podpory. Pro návod a doporučení, jak nejlépe připravit vzorky, jakmile jsou v suspenzi, je dobrým výchozím bodem náš průvodce přípravou jednotlivých buněk, kde se můžete dozvědět více o osvědčených postupech a prohlédnout si obecný protokol. Pokud se učíte spíše vizuálně, naše videa s návody, zejména kapitoly 4 až 7, by vám měla pomoci projít procesem přípravy vzorků a knihoven.

• Příručka pro přípravu jednotlivých buněk

• Demonstrační protokoly

• Jak-.to-videa

• Chromium™ Controller

• Příručky pro uživatele

• Jak-to-videa

• Software Cell Ranger™

• Loupe™ Cell Browser

• Návody k použití

Analýza vašich dat, jednu buňku po druhé

Po přípravě vaší knihovny se provádí sekvenování pomocí sekvenačních přístrojů Illumina®. To vede k zábavné části: získání biologických poznatků z vašich dat RNA-seq z jedné buňky! S (potenciálně) obrovským množstvím dat, která vygenerujete pomocí řešení Chromium Single Cell 3′ Solution, si snadno poradí náš software a vizualizační nástroje, které byly navrženy tak, aby vás zbavily mnoha dohadů – software Cell Ranger™ transformuje sekvenační data s čárovým kódem do souborů připravených pro analýzu exprese jednotlivých buněk a vizualizace se provádí pomocí prohlížeče Loupe™ Cell Browser. Pokud byste chtěli získat návod na používání našeho softwaru krok za krokem, v kapitolách 8 až 11 našich videí s návodem se dozvíte vše od počítání transkriptů pomocí softwaru Cell Ranger až po krásnou vizualizaci dat pomocí prohlížeče Loupe Cell Browser. K dispozici je také rostoucí počet nástrojů pro analýzu jednotlivých buněk vyvinutých komunitou, včetně nástrojů Seurat, Monocle a Cell View. Více informací o těchto analytických nástrojích a dalších článcích o jednobuněčných datech si můžete přečíst na blogu 10x Genomics Blog, kde upozorňujeme na důležité příspěvky k výzkumu, poskytujeme tipy a triky a informujeme vás o všem, co se týká jednobuněčných dat!

Pokud máte další dotazy nebo obavy ohledně začátku používání řešení Chromium Single Cell 3′ Solution, neváhejte zanechat komentář zde nebo nás kontaktujte přímo. Ať už se jedná o sledování vývoje mozkových organoidů, studium transplantace kostní dřeně u pacientů s akutní myeloidní leukémií nebo odhalení nové cesty sebeobnovy střevních kmenových buněk, počet publikací v Chromium Single Cell denně roste a my se těšíme na zprávy o všech vašich úžasných výzkumech!