18O značení: nástroj pro proteomiku

Představeno je hodnocení proteolytického značení a kvantifikace proteinů pro diagnostické účely pomocí trypsinu a H2O obohaceného o 18O. Ukazujeme, že tímto přístupem lze efektivně provádět srovnávací nebo relativní kvantifikaci. Vyvinuli jsme protokol, který umožňuje zachování značených peptidů v přirozeném množství vody bez obav ze zpětné výměny za předpokladu, že pH je dostatečně nízké, aby zhášelo katalytickou aktivitu trypsinu, ale ne tak nízké, aby podporovalo chemickou zpětnou výměnu. Protože účinnost značení závisí na povaze peptidu, neexistuje jednoduchý lineární vztah mezi relativním obsahem 16O/18O ve směsi pufrů (x) a účinností značení (y); spíše se řídí pravděpodobnostním vztahem y = x(2). Rozsah značení peptidů pomocí poměrů 16O/18O rozkladné pufrovací směsi se tak může výrazně lišit od očekávaného na základě lineárního vztahu. Vyhodnocení relativní účinnosti Ziptipu ukázalo ztrátu výtěžnosti vzorku při snižování koncentrace peptidů za normálních podmínek, což naznačuje, že existuje hranice, pod níž dochází ke snižování výtěžnosti. Kromě toho adsorpční ztráty způsobené vysycháním Speedvacu a obnovou ukázaly mírné (20%) ztráty, které se mohou značně lišit (0-50%) od peptidu k peptidu. Účinnost rozkladu standardních směsí proteinů v roztoku v závislosti na koncentraci ukázala lineární pokles s klesající koncentrací. To je v souladu s kinetickými účinky enzymů a zdůrazňuje potenciální chybu v kvantifikaci, která by mohla vzniknout při hodnocení rozdílné exprese na základě detekce peptidů. Výsledky našich studií ukazují sílu značení 18O jako optimalizačního nástroje pro vývoj proteomických procesů.