Analýza a kvantifikace fúze myoblastů in vitro pomocí vícenásobného barvení LADD

Dospělá kosterní svalová tkáň obsahuje populaci prekurzorových buněk, známých jako satelitní buňky, které jsou zodpovědné za obnovu kosterního svalu (1-3). Aktivované satelitní buňky (myoblasty) migrují do místa svalového traumatu, kde proliferují, diferencují se a fúzují do vícejaderných myotub (3-5). Konečný úspěch tohoto procesu se měří podle toho, do jaké míry rezidentní myoblasty během terminální diferenciace splynuly.

Pro experimentální hodnocení fúze myoblastů in vitro se vypočítává index fúze na základě detekce imunofluorescence pomocí mikroskopie. Fluorescenčně značené protilátky se používají k detekci strukturálních proteinů svalových vláken, jako je těžký řetězec myozinu (MyHC) a desmin, nebo lze alternativně použít fluorescenčně značený falloidin k vizualizaci F-aktinu (6-9). Jádra se fluorescenčně značí pomocí sloučeniny vázající DNA, jako je Hoechst 33258. Následně se vypočítá buď procento jader v myocytech s ≤3 jádry (9), nebo procento jader v MyHC pozitivních myotubech (10). Tyto přístupy jsou dobře zavedené, nicméně vyžadují rozsáhlou a časově náročnou optimalizaci pro vytvoření silného a specifického signálu pro zájmový antigen a následnou fúzní analýzu. Pokud se používají fluorescenčně značené protilátky, je dalším požadavkem přístup k fluorescenčnímu mikroskopu, který není dostupný ve všech institucích. Následná kvantifikace vyžaduje pracnou a časově náročnou analýzu mnoha zorných polí za účelem získání fúzního indexu reprezentativního pro populaci. Tato omezení spolu s relativní nákladností testů založených na protilátkách nás přiměly k vývoji rychlého a nákladově efektivního in vitro testu pro kvantifikaci fúze myoblastů pomocí široce dostupného LADD Multiple Stain.

LADD Multiple Stain (11) je kombinované jaderné a cytoplazmatické barvivo, které obsahuje fuchsin a toluidinovou modř (kat. č. 70955; LADD Research Industries, Williston, VT). Pro naše studie se čerstvý LADD připravuje tak, aby obsahoval 0,365 g toluidinové modři (kat. č. #89640-5G; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a 0,135 g fuchsinu (kat. č. #47860-25G; Sigma- Aldrich) v konečném objemu 50 ml 30% ethanolu. Roztok se míchá do rozpuštění a poté se filtruje přes filtrační papír Whatman (číslo 4) (kat. č. 09-825B, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Barvivo LADD lze skladovat v plastové nebo skleněné nádobě při pokojové teplotě a lze je opakovaně použít. Buňky, které mají být obarveny, se promyjí fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem (PBS) a fixují se v 70% ethanolu po dobu 10 minut. Etanol se odstraní a přidá se 500 µl barviva LADD, čímž se zajistí plné pokrytí buněk. Buňky se inkubují 1 min, poté se barvivo odstraní a buňky se opakovaně promyjí destilovanou vodou, dokud se LADD nepřestane vyluhovat do vody. Buňky se poté nechají oschnout a uchovávají se při pokojové teplotě, dokud se neprohlédnou pomocí světelné mikroskopie s fázovým kontrastem. Pro zlepšení osvětlení během prohlížení lze obarvené buňky ponořit do PBS.

Pro zjištění, zda lze toto barvení úspěšně využít k vizualizaci fúze myoblastů, byly buňky C2C12 vypěstovány do 80% konfluence (obrázek 1A) za standardních kultivačních podmínek (12). Poté bylo médium změněno na diferenciační médium obsahující 2% koňské sérum, což vedlo k fúzi do myotub (obr. 1B). Úspěšná diferenciace byla potvrzena zvýšenou expresí MyHC (obrázek 1D) ve srovnání s nediferencovanými buňkami (obrázek 1C). Po barvení LADD vykazují nediferencované myoblasty C2C12 světle fialovou cytoplazmu a tmavší jádro (obrázek 1E; šipka). Po diferenciaci se však cytoplazma myotub objevuje tmavě fialová (Obrázek 1F; šipky), zatímco uvnitř vícejaderné buňky jsou jasně viditelná světlejší jádra (Obrázek 1F; šipka). Proto jsou po vícenásobném barvení LADD pozorována jasně definovaná jádra, která jsou stejně snadno odlišitelná od cytoplazmy vícejaderné myotuby (Obrázek 1F), jak je vidět pomocí fluorescenční mikroskopie po imunocytochemii (Obrázek 1D).

Pro zjištění, zda lze analýzu obrazu použít k měření průběhu fúze myoblastů, byly buňky C2C12 diferencovány po dobu 6 dnů a snímky buněk obarvených LADD byly pořízeny při 200× zvětšení pomocí inverzního světelného mikroskopu Olympus CKX41 (Olympus Corporation, Tokio, Japonsko). Podle očekávání se počet fúzujících myocytů a myotub zřetelně zvyšoval v každém dalším dni diferenciace (obr. 2A). Poté byl vypočítán fúzní index a bylo zjištěno, že diferencující se myoblasty postupně zvyšují svůj fúzní index z 0,45 % (1. den) na 31,4 % (6. den) (obr. 2B). Takto získaný fúzní index je příznivě srovnatelný s indexem vypočteným pomocí standardní imunocytochemie (k detekci MyHC) a jaderného barvení (13). Aby se zjistilo, zda lze software pro analýzu ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) přizpůsobit ke kvantifikaci plochy myofibry (jako míry fúze), bylo vyvinuto makro, které bylo otestováno na snímcích znázorněných na obrázku 2A. Makro je nastaveno následujícím způsobem a poté uloženo:

• Otevřete ImageJ a klikněte na „Plugins = > Macros = > Startup Macros“

• Nahraďte stávající text kódováním uvedeným v doplňkové tabulce S1.

Obrázky se otevřou v programu ImageJ a makro se spustí kliknutím na „Macros = > Run Macro“. Tím se obrázky analyzují jeden po druhém. Uživatel musí potvrdit, že byl správně nastaven práh; analyzovat by se měla pouze oblast myofibry. Barevný práh lze změnit úpravou řádku makra „setThreshold(0,130)“; zvýšením druhého čísla bude zahrnuto více lehce zbarvených oblastí, zatímco při snížení tohoto čísla bude více oblastí vyloučeno. Při použití této metody dosáhla plocha myofibry v 6. den 29,6 % (obrázek 2C), což se dobře srovnává s indexem fúze vypočteným pro stejný časový bod (obrázek 2B). Barviva Jenner a Giemsa lze také použít k barvení myotub pro světelnou mikroskopii podobně jako LADD, avšak barvení pomocí LADD je mnohonásobně rychlejší a makro ImageJ, které jsme vyvinuli, umožňuje větší kontrolu nad tím, které oblasti jsou měřeny (14).

Pro další ověření použití vícenásobného barvení LADD pro analýzu fúze byly buňky C2C12 diferencovány po dobu 5 dnů v přítomnosti nebo nepřítomnosti 10 µM BB94 (kat. č. ab142087; Abcam, Cambridge, UK) a následně fixovány a obarveny pomocí LADD, jak bylo popsáno dříve. BB94 je komerčně dostupný syntetický inhibitor matrixové metaloproteázy, u kterého bylo dříve prokázáno, že snižuje fúzi myoblastů (15,16). V přítomnosti BB94 se index fúze významně snížil z 50 % (DMSO kontrola) na 22 % (P < 0,05) (obr. 2D); analýza plochy myofibry odhalila stejný trend, přičemž fúze se snížila ze 46 % (DMSO kontrola) na 21 % (P < 0,05).05) v přítomnosti BB94 (obr. 2E).

Představujeme zde rychlou, novou metodu barvení struktury myofibry i přidružených myonukleárů pomocí vícenásobného barvení LADD. ImageJ je následně použit k přesnému vyhodnocení plochy svalových vláken jako míry fúze. Relativně nízká cena LADD a výrazně zkrácený čas potřebný pro zpracování a analýzu znamená, že fúzi lze nyní rychle analyzovat ve standardní laboratoři bez nutnosti imunocytochemie a fluorescenční mikroskopie.

.