Axiální rozlišení

Boční a axiální rozlišení ve světelném mikroskopu je v zásadě difrakčně omezeno vztahem mezi vlnovou délkou světla a aperturou neboli úhlem přijetí objektivu použitého pro zobrazování, jak popsal Ernst Abbe v roce 1873. V laterálním rozměru je tento limit rozlišení přibližně 200 nm a v axiálním rozměru je tento limit přibližně 500 nm. Difrakční limit optické mikroskopie vychází ze základních omezení optiky používané při tvorbě obrazu. Uvažujeme-li obraz vytvořený sférickým zdrojem světla s nižším rozlišením, zjistíme, že obraz, který je výsledkem i dokonale korigované optiky mikroskopu bez aberací, není popsán jednoduchou koulí. Ve skutečnosti pozorujeme složité 3D rozložení intenzity v ohnisku a toto 3D rozložení intenzity lze matematicky popsat funkcí bodového rozptylu (PSF) (obrázek 1). Centrální maximum PSF obsahuje 86,5 % celkové dostupné intenzity energie. V bočním i axiálním rozměru je zbývající energetická intenzita mapována do řady maxim a minim rotačně symetrickým způsobem. Právě vzájemné působení PSF ze sousedních obrazových prvků v konečném důsledku určuje hranici difrakčního rozlišení světelného mikroskopu.

Obrázek 1: Difrakční rozlišovací schopnost světelného mikroskopu. Mapy intenzity XY (a) a XZ (b) ideální funkce rozptylu bodu.

V bočním rozměru xy je FWHM PSF dána rovnicí

Z obou rovnic vidíme, že laterální a axiální rozlišení závisí na numerické apertuře optické soustavy sbírající světlo a vlnové délce samotného světla. Lepší rozlišovací schopnost je dána použitím objektivů s vysokou numerickou aperturou a kratší vlnovou délkou světla. Tuto minimální rozlišovací vzdálenost ovlivňují i další faktory, jako je relativní jas obou objektů (kontrast). Z praktického hlediska je při zobrazování mikroskopem pro přesné zobrazení subcelulárních detailů nutná jak dostatečná optická numerická apertura, tak dostatečný kontrast.

Snižování vlnové délky osvětlení do ultrafialové oblasti za účelem zlepšení rozlišovací schopnosti omezuje možnosti výběru fluorescenčních sond a posouvá hranice optických korekcí a přenosových vlastností optické dráhy mikroskopu. Další komplikace vyplývají z použití ultrafialového osvětlení ve studiích živých buněk, kde mnoho výzkumníků zaznamenalo škodlivé účinky těchto vlnových délek na dlouhodobou životaschopnost buněk. Moderní optické konstrukce zlepšily numerické apertury objektivů, ačkoli skutečné zlepšení v tomto ohledu přišlo až s použitím exotických montážních médií a materiálů krycích skel. Obě tyto strategie nedokáží dosáhnout většího než mírného zlepšení rozlišení a jsou na úkor toho nepraktické pro studium živých buněk.

Biologická konfokální mikroskopie, která používá dírkovou aperturu ke zlepšení kontrastu v ohnisku účinným odstraněním rozptýleného světla z rozostřených rovin objektu, se stala standardním zobrazovacím nástrojem při studiu vztahů mezi buněčnou strukturou a funkcí . Zlepšení vizualizace roviny obrazu v ohnisku umožňuje snadněji dosáhnout praktických difrakčních mezí rozlišení při kritickém nastavení přístroje. Teoreticky se při apertuře pinhole menší než 1 Airyho jednotka boční a axiální rozlišení skutečně zlepší na hranici 1,4násobku rozlišení v případě širokoúhlého mikroskopu. V praxi však průměry dírkových otvorů menší než 1 Airyho jednotka poskytují příliš málo světla pro biologické zobrazování, protože velká část záření v ohnisku je dírkovým otvorem odmítnuta spolu s nežádoucím světlem mimo ohnisko. Pro biologické zobrazování, kde se obvykle bojuje o získání emisního signálu, je odmítnutí části tohoto omezeného signálu za malý zisk rozlišení nepraktické. Ve skutečnosti, když je emisní signál ze vzorku omezený, se obvykle volí otevření pinhole na průměr větší než 1 Airyho jednotka, aby se zachytilo více signálu na úkor větší tloušťky optického řezu. Při těchto průměrech dírky je rozlišení konfokálního mikroskopu v podstatě stejné jako u běžného širokoúhlého fluorescenčního mikroskopu.

To neznamená, že nelze detekovat objekty, které jsou menší než limit rozlišení – detekce je možná i na úrovni jednotlivých molekul, a to nyní poměrně jednoduše s využitím moderních technologií detektorů. Úplné odstranění přímého osvětlení vstupujícího do objektivu při mikroskopii v temném poli vytváří vynikající kontrast, takže lze snadno pozorovat i malé množství světla rozptýleného difrakčně omezenými objekty, jako jsou mikrotubuly (průměr 25 nm). Fluorescenční mikroskopie rovněž poskytuje vynikající kontrastní podmínky, které mohou umožnit pozorování a záznam objektů, jejichž rozměry jsou hluboko pod difrakčním limitem rozlišení. Při fluorescenční mikroskopii s úplným vnitřním odrazem (TIRF) se kontrast oproti standardní fluorescenční mikroskopii se širokým polem zlepšuje omezením axiální excitace na několik stovek nanometrů od rozhraní tekutiny a krycího skla pomocí evanescentní energie světla v blízkém poli pro excitaci fluoroforů. Za těchto podmínek lze ve velmi tenkém optickém řezu sledovat i pohyblivost jednotlivých molekul v čase. Mikroskopie v temném poli ani mikroskopie TIRF však nezlepšují rozlišení optického systému – obě techniky se spoléhají na velké rozdíly kontrastu mezi objektem zájmu a pozadím, které umožňují detekci s nižším rozlišením.

Překročení klasických hranic difrakčního rozlišení představovalo v moderní světelné mikroskopii velkou výzvu. Výhody plynoucí ze zlepšení naší schopnosti rozlišit jemnější detaily z optického mikroskopu jsou zřejmé. Větší rozlišení by umožnilo přesnější strukturní popis molekulárních organizací zásadních pro normální i abnormální buněčnou fyziologii a chování. Molekulární a biochemické disekce jdou jen do určité míry odhalit složitost funkčních organizací, jako jsou ty, které se nacházejí v adhezních fokálních kontaktech. Možnost přímé vizualizace těchto funkčních organizací s rozlišením blížícím se molekulárnímu rozměru by podstatně zvýšila naše chápání vzájemných molekulárních vztahů a změn v organizaci souvisejících s funkčními nebo fyziologickými stavy. V poslední době řada výzkumníků využila několik různých strategií, které umožňují podstatné (2 až 10násobné nebo lepší) zlepšení klasických limitů laterálního a axiálního rozlišení . Tyto techniky se dělí do dvou obecných kategorií: techniky, které se spoléhají na změny v osvětlení vzorku, a techniky, které využívají strategie detekce jednotlivých molekul spolu s časovým rozměrem k vytvoření superrozlišeného obrazu.

Pro účely tohoto článku byly vybrány techniky, které vedly k vývoji a zavedení komerčních přístrojů několika výrobců. Použití tohoto specifického kritéria při výběru níže diskutovaných metod nelze v žádném případě interpretovat jako podporu těchto technik oproti jiným, které byly uvedeny v literatuře. S dalším rozvojem prací v této rychle se měnící oblasti se může stát, že nové metody a přístupy předstihnou ty, které jsou popsány níže. Uvedení těchto komerčních přístrojů na trh však umožňuje širokému okruhu biologů z různých oborů aplikovat metody superrozlišení na jejich vlastní specifické biologické otázky, čímž se tyto metody dostávají mimo specializované vývojové laboratoře. Čtenářům doporučujeme, aby sami prozkoumali vysoce kvalitní snímky obsažené v doplňkovém materiálu online, který doprovází mnoho odkazovaných článků.

.