Jednodoménové protilátky neboli nanobodies se nedávno dostaly do centra pozornosti jako potenciální léčba COVID-19. Léčba COVID-19 na bázi nanotěl vyvinutá australskou biotechnologickou společností Beroni Group je v současné době ve fázi preklinického testování. Přestože nanoprotilátky teprve začínají využívat svůj terapeutický potenciál, studují se již desítky let.
V roce 1989 dva postgraduální studenti na Vrije Universiteit Brussel náhodně objevili jedinečnou vlastnost velbloudů (mimo jiné velbloudů, lam a alpak). Při testování zmrazeného velbloudího krevního séra studenti zjistili, že velbloudi produkují nejen konvenční protilátky, ale také jedinečnou sekundární sadu jednořetězcových protilátek (scAbs) složenou ze dvou identických polypeptidů s těžkým řetězcem, z nichž každý obsahuje dvě sousedící konstantní domény, oblast závěsu a variabilní doménu. (Konstantní domény každého těžkého řetězce probíhají paralelně; za oblastí závěsu se variabilní domény rozcházejí jako ramena písmene „Y“). Každá z variabilních domén scAb slouží jako modul vázající antigen.
Tento vzrušující objev byl jen začátkem. Následná práce odhalila, že k rozpoznání antigenu je zapotřebí pouze malý fragment scAb, jediná variabilní doména. Tento fragment váží pouhých 12-15 kDa, odtud název „nanotělo“.
Naproti tomu lidské protilátky se skládají ze dvou identických polypeptidů těžkého řetězce a dvou identických polypeptidů lehkého řetězce. Tyto bílkoviny jsou velké, s molekulovou hmotností přibližně 150 kDa. Na rozdíl od velbloudích scAbs se vazebné místo antigenu lidských protilátek rozprostírá jak na těžkém, tak na lehkém řetězci (nebo spíše na variabilních doménách těchto řetězců), což znamená, že k detekci antigenu jsou zapotřebí všechny řetězce.
Výhody nanobody
Protože jsou lidské protilátky velké, mají často potíže s přístupem do malých vazebných prostorů na virech, některých buňkách a cílech hluboko v nádorové tkáni. Malé nanotělesa se však mohou pohybovat v těsných prostorech a mohou být atraktivní alternativou k lidským protilátkám pro vývojáře léčebných postupů. Kromě toho je vazebná doména nanoprotilátek dlouhá a vytváří strukturu podobnou „prstu“, která zvyšuje schopnost nanoprotilátek dosáhnout svých cílů.
Jednou z obrovských výhod nanoprotilátek ve srovnání s běžnými lidskými protilátkami je jejich snadná vyrobitelnost. Relativně jednoduchý proces začíná imunizací velblouda požadovaným antigenem. Imunitní systém velblouda produkuje scAb, která rozpoznává antigen. Následně je velbloudovi odebrán vzorek krve (který je jinak ponechán bez poškození) a ze vzorku je extrahována mRNA pro scAb.
Z mRNA jsou poté amplifikovány geny pro variabilní doménu vázající antigen, tj. nanotvar. Velké množství finálního nanotělesa pak může být vyrobeno uvnitř mikroorganismů, typicky Escherichia coli, při nízkých nákladech.
Nové metody zcela vyřazují zvířata z rovnice tím, že testují antigeny proti předem vyrobené knihovně nanotěles. Společnost Twist Bioscience prostřednictvím své divize Twist BioPharma nabízí několik typů knihoven nanotěl v rámci lamy scAb nebo částečně humanizované scAb. Najednou lze testovat miliardy sekvencí nanotěl, díky čemuž je objevování a vývoj protilátek extrémně rychlý a relativně levný.
Použití nanotěl
Původně se nanotěla používala pouze nebo především pro výzkumné účely. V posledním desetiletí se však dramaticky rozšířilo zkoumání využití nanotěl jako terapeutického prostředku. V únoru 2019 došlo k významnému pokroku, když FDA schválila první terapeutické nanotěleso.
Lék s názvem Cablivi vyvinula společnost Ablynx pro léčbu získané trombotické trombocytopenické purpury. Cablivi působí jako anti-Von Williebrandův faktor a zabraňuje shlukování krevních destiček kolem orgánů.
V klinických zkouškách se nacházejí nanoprotilátky pro různá onemocnění. Například nanotělíska jsou hodnocena jako léčba psoriázy, revmatoidní artritidy a virových infekcí.
Kromě toho, že nanotělíska představují samostatnou léčbu, mohou přispět ke kombinované léčbě. Zajímavé jsou klinické studie zkoumající kombinaci nanotělísek a terapie rakoviny pomocí chimérických antigenních receptorů (CAR) T-buněk.
CAR T-buňky jsou geneticky upraveny tak, aby rozpoznávaly antigeny na povrchu nádorů a zaměřovaly se na ně. Terapie CAR T-buňkami jsou zatím velmi slibnou léčbou rakoviny krve, která nereaguje na konvenčnější léčbu. Terapie pomocí CAR T-buněk však zatím nebyla úspěšná u solidních nádorů.
Pro léčbu solidních nádorů se CAR T-buňky možná budou muset zaměřit na alternativní cíle. K obvyklým cílům patří antigeny specifické pro rakovinu, které je obtížné najít, a antigeny spojené s rakovinou, které je snazší najít, ale je obtížnější je bezpečně zasáhnout, protože se objevují i na zdravých buňkách.
Tyto cíle představují ještě jednu další obtíž. Obvykle se na ně zaměřují CAR T-buňky, které obsahují antigen-rozpoznávací doménu odvozenou od lidské monoklonální protilátky. Lidské protilátky však mohou způsobovat imunogenicitu vedoucí k vedlejším účinkům a snížení účinnosti buněk CAR T.
Jaké alternativní cíle by mohly být vhodné? Možností je mnoho v extracelulární matrix, což je síť proteinů, která chrání solidní nádory a ukrývá imunosupresivní molekuly. Myšlenka zasáhnout cíle v extracelulární matrix oslovila vědce z Bostonské dětské nemocnice. Nakonec se tito vědci rozhodli vytvořit CAR T buňky s antigenně rozpoznávacími doménami odvozenými z nanotěl.
Na myších modelech rakoviny vědci prokázali, že CAR T buňky na bázi nanotěl jsou jen slabě imunogenní a schopné rozpoznávat specifické antigeny v nádorovém mikroprostředí. Ke konstrukci těchto CAR T buněk vědci použili metodu Gibson Assembly, což je technika, která umožňuje kombinovat a klonovat více fragmentů DNA.
Konstrukty CAR T buněk s nanobody jsou schopny poškozovat krevní cévy vyživující nádor a prvky extracelulární matrix chránící nádor. Poškození nádorového mikroprostředí významně zpomaluje růst a umožňuje dalším léčebným postupům, například chemoterapii, přístup do nitra nádoru.
Problémy vývoje nanobody
Po objevení nanobody v roce 1989 trvalo 30 let, než se léčebný přípravek s nanobody dostal na trh. Prvních 10 let bylo zaměřeno na výzkum struktury, složení a vlastností nanotěl. Hned po uplynutí deseti let, v roce 2001, se Vrije Universiteit Brussel pokusila o komercializaci nanotěl s několika patenty vydanými na její jméno. Tyto patenty byly následně převedeny na Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie (VIB) a poté v roce 2002 na společnost Ablynx založenou VIB.
Je pravděpodobné, že omezení duševního vlastnictví týkající se složení hmoty nanotěl přispěla k dlouhé prodlevě mezi objevem nanotěl a prvním schválením léku na bázi nanotěl. Hlavní patentové nároky na tuto biomolekulu však vypršely v roce 2014 v Evropě a v roce 2017 v Americe, což společnosti Ablynx umožnilo výrazně rozšířit spolupráci s některými z největších farmaceutických společností na světě, včetně společností Merck & Co, Boehringer Ingelheim a Sanofi.
Tyto spolupráce vyústily v příval registrovaných klinických studií zahrnujících nanotělesa a dlouho očekávané schválení přípravku Cablivi. Navíc zmenšující se překážky duševního vlastnictví spojené se složením hmoty nanotvarů umožnily ještě více společnostem projevit zájem o další komercializaci těchto supermolekul.
Stejně jako všechny terapie mají i nanotvary své nevýhody. Jejich malá velikost má za následek rychlé vylučování ledvinami, což zkracuje jejich poločas rozpadu. Proto je k zajištění dostatečně velkého objemu nanotělísek v krvi pro dosažení požadovaného účinku nutné časté dávkování, které může vyvolat toxicitu pro ledviny. Existuje také malé riziko, že by u pacientů mohlo dojít k imunitní reakci na terapeutická nanotělka, protože se jedná o biologický materiál.
Naštěstí lze tyto problémy překonat. Výzkum ukázal, že spojení nanotělísek se sérovým albuminem, hojným transportním proteinem, který se nachází v krvi, výrazně prodlužuje poločas rozpadu nanotělísek, což jim umožňuje zůstat v krvi déle a ve větším množství. Imunogenitu nanotěl lze snížit humanizací, což je proces, při kterém se upraví některé proteinové sekvence nanotěl tak, aby se zvýšila jejich podobnost s lidskými protilátkami, čímž se sníží riziko negativní imunitní reakce.
Přestože došlo ke zpoždění komercializace nanotěl jako terapeutik, nyní, když je mnoho společností schopno investovat do těchto úžasných a jedinečných molekul, se očekává, že brzy dojde k explozi nanotěl, která se budou používat jako terapeutika pro mnoho nemocí, od virových infekcí po rakovinu. Kamelidová nanotělíska nejenže prokázala svou hodnotu, ale mohla by také změnit podobu protilátkové terapie a gradovat v nové generaci terapeutik.