Thioly reagují s touto sloučeninou štěpením disulfidické vazby za vzniku 2-nitro-5-thiobenzoátu (TNB-), který ve vodě při neutrálním a alkalickém pH ionizuje na dianion TNB2-. Tento TNB2- iont má žlutou barvu.
Tato reakce je rychlá a stechiometrická, přičemž přidáním jednoho molu thiolu se uvolní jeden mol TNB. TNB2- se kvantifikuje ve spektrofotometru měřením absorbance viditelného světla při vlnové délce 412 nm s použitím extinkčního koeficientu 14 150 M-1 cm-1 pro zředěné roztoky pufru a koeficientu 13 700 M-1 cm-1 pro vysoké koncentrace solí, jako je 6 M guanidiniumhydrochlorid nebo 8 M močovina. Bohužel v původní publikaci z roku 1959 byl extinkční koeficient pro zředěné roztoky podhodnocen na 13 600 M-1 cm-1, a jak bylo uvedeno v nedávném článku, tato chyba v literatuře přetrvává. Komerční DTNB nemusí být zcela čistý, takže k získání zcela přesných a reprodukovatelných výsledků může být nutná rekrystalizace.
Ellmanovo činidlo lze použít k měření nízkomolekulárních thiolů, jako je glutathion, jak v čistých roztocích, tak v biologických vzorcích, jako je krev. Lze jím také měřit počet thiolových skupin na bílkovinách.