Pro demonstraci využití Escher-FBA pro reálné aplikace uvádíme čtyři klíčové příklady FBA, které lze spustit přímo v prohlížeči. Jsou převzaty z přehledu FBA a jejích aplikací . Tyto příklady se opírají o výchozí model jádra E. coli, takže jsou připraveny k provedení ihned po otevření webové stránky Escher-FBA. Nezapomeňte mezi jednotlivými příklady kliknout na tlačítko Obnovit mapu. Pokud máte potíže s nalezením reakce, jednoduše klikněte na možnost Najít v nabídce Zobrazení (nebo na klávesu „f“ na klávesnici) a otevřete vyhledávací panel.
FBA s alternativními uhlíkovými substráty
První příklad demonstruje použití FBA k předpovědi, zda může dojít k růstu na alternativních uhlíkových substrátech. Výchozí základní model E. coli zahrnuje simulované minimální médium s D-glukózou jako zdrojem uhlíku. Zde změníme zdroj uhlíku z D-glukózy na sukcinát. Nejprve najeďte myší na reakci výměny sukcinátu EX_succ_e a změňte dolní hranici na – 10 mmol/gDW/hod. buď přetažením posuvníku, nebo zadáním – 10 do pole Lower Bound (Dolní hranice). Dále najeďte myší na výměnnou reakci D-glukózy EX_glc_e a buď zvyšte dolní mez na 0, nebo klikněte na tlačítko Knockout (Vyřadit). Výchozím cílem je stále maximalizace růstu, takže tyto dvě změny dají programu pokyn, aby vypočítal maximální rychlost růstu při použití sukcinátu jako zdroje uhlíku místo D-glukózy. Měli byste vidět, že maximální předpokládaná rychlost růstu se sníží z 0,874 h- 1 na 0,398 h- 1, což odráží nižší výtěžnost růstu E. coli na sukcinátu (obr. 2a). Toto je obecný přístup k provádění změn v Escher-FBA; najedete myší na reakci, provedete požadované změny a Escher-FBA automaticky zobrazí vaše výsledky. Dolní mezní hodnoty pro výměnu zdrojů uhlíku představují experimentální měření, takže můžete zkusit upravit konkrétní dolní mezní hodnotu na realistické hodnoty pro růst na jiných zdrojích uhlíku.
Příklady simulací Escher-FBA. (a) Simulovaný růst se sukcinátem jako jediným zdrojem uhlíku. (b) Simulovaný anaerobní růst na médiu s minimem glukózy. (c) Maximalizace výtěžku ATP ve výchozím modelu. (d) Růst modelu iMM904 S. cerevisiae. Všimněte si, že v nabídce nastavení byla zvětšena šířka šipek, aby byly změny zřetelnější
FBA během anaerobního růstu
Anaerobní růst lze simulovat stejným způsobem tak, že najedete myší na reakci EX_o2_e a buď kliknete na možnost Knockout, nebo změníte dolní mez na 0. Pokud změníte výměnu kyslíku na nulu, zatímco jediným zdrojem uhlíku je stále sukcinát, indikátor Flux Through Objective (Tok přes cíl) zobrazí „Infeasible solution/Dead cell“ (Neproveditelné řešení/Mrtvá buňka), což znamená, že růst není možný. Zkuste kliknutím na tlačítko Reset v pravém dolním rohu simulovat minimální médium s D-glukózou jako zdrojem uhlíku, poté vyřaďte EX_o2_e a předpokládaná rychlost růstu by měla být 0,211 h- 1 (obr. 2b).
FBA se složenými cíli
Escher-FBA podporuje nastavení více cílů v režimu Compound Objectives. Ve výchozím modelu nastavení nového cíle vždy deaktivuje předchozí cíl. Chcete-li tento režim zapnout, klikněte nejprve na tlačítko Složené cíle ve spodní části obrazovky. Příklad použití režimu: Chcete-li zkontrolovat maximální rychlost růstu při minimalizaci toku přes SUCDi, začněte s výchozím cílem maximalizace produkce biomasy. Poté najeďte myší na označení reakce pro SUCDi a klikněte na tlačítko Minimize (Minimalizovat) v rámci nápovědy. V pravém dolním rohu byste měli vidět oba cíle v seznamu. Všimněte si, že v současné době jsou podporovány pouze cílové koeficienty 1 nebo – 1 (reprezentované položkami Maximize (Maximalizovat) a Minimize (Minimalizovat)). Chcete-li se vrátit k jednotlivým cílům, stačí znovu kliknout na tlačítko Compound Objectives (Složené cíle).
Analýza metabolických výtěžků
Můžeme také použít Escher-FBA ke stanovení maximálních výtěžků prekurzorů a kofaktorů, například ATP. Vše, co je zapotřebí, je stechiometricky vyvážená reakce, při níž se spotřebovává kofaktor, který nás zajímá. Takovým příkladem je reakce udržování ATP (ATPM). Chcete-li určit maximální produkci ATP, jednoduše najeďte myší na reakci ATPM a klikněte na tlačítko Maximize (Maximalizovat). Nastavení cíle tímto způsobem funguje, protože aby systém maximalizoval tok prostřednictvím reakce ATPM, musí nejprve produkovat ATP v co největším množství. Při maximalizaci ATPM ve výchozím modelu metabolismu jádra E. coli je hodnota cíle 175 mmol/gDW/hod. (obr. 2c). Při použití sukcinátu jako zdroje uhlíku se tato hodnota sníží na 82,5 mmol/gDW/hod. Stejný postup lze použít pro jakýkoli zajímavý metabolit vytvořením stechiometricky vyvážené spotřební reakce a nastavením modelu na maximalizaci toku touto reakcí. Všimněte si, že v současné době není možné takovou reakci v Escher-FBA vytvořit automaticky, ale lze to přidat do některé z budoucích verzí.
Analýza variability toku
Analýza alternativních optimálních řešení v metabolismu je další užitečnou aplikací FBA . Vzhledem k tomu, že řešení vytvořená pomocí FBA jsou často nejednotná, může být užitečné znát rozsah hodnot toku, které může mít určitá reakce. Analýza variability toku (FVA) se často používá k výpočtu těchto rozsahů v celé síti . Escher-FBA nepodporuje výpočty FVA přímo, ale je možné je pro danou reakci vypočítat. Za tímto účelem nejprve najeďte myší na cílovou funkci (reakce Biomass_Ecoli_core_w_GAM) a nastavte horní a dolní hranici na hodnotu o něco nižší, než je aktuální hodnota toku (ve výchozí mapě zkuste 0,870). Poté najeďte myší na reakci, která vás zajímá, a kliknutím na tlačítka Maximize (Maximalizovat) a Minimize (Minimalizovat) zobrazte maximální a minimální tok danou reakcí při optimální rychlosti růstu. Například při maximalizaci a minimalizaci toku přes GAPD v glykolýze získáte proveditelný rozsah toku 15,44-16,68 mmol/gDW/hod, což naznačuje, že glykolytický tok je při vysokých růstových rychlostech velmi omezený. Na druhé straně maximalizace a minimalizace toku přes MALS v glyoxylátovém zkratu dává proveditelný rozsah toku 0-2,64 mmol/gDW/hod, což naznačuje, že glyoxylátový zkrat může být při vysokých růstových rychlostech aktivován nebo neaktivován. Tento postup lze provést s libovolnou sadou reakcí a uživatel může svůj systém omezit na libovolný počet hodnot toku, aby zjistil rozsah řešení dostupných pro konkrétní reakci.
Použití jiných modelů v měřítku genomu
Výchozí model jádra E. coli není jediný systém, který lze simulovat. Pokud si například přejeme spustit simulace na kvasinkové buňce, lze model a mapu pro Saccharomyces cerevisiae stáhnout ze stránek http://bigg.ucsd.edu/models/iMM904. Na této stránce klikněte na tlačítko pro stažení modelu (iMM904.json) a mapy (iMM904.Central carbon metabolism.json). Načtěte je v Escher-FBA kliknutím na tlačítko Load Map JSON v nabídce Map a Load Model JSON v nabídce Model, čímž načtete oba soubory JSON. Po načtení je mapa připravena k úpravám a simulaci pomocí libovolného nástroje v programu Escher nebo Escher-FBA (obr. 2d). U většího modelu, jako je iMM904, nebudou všechny reakce viditelné najednou, ale můžete reakci přidat do vizualizace. Nejprve buď klikněte na ikonu klíče na postranním panelu, nebo vyberte možnost Add reaction mode (Přidat režim reakce) z nabídky Edit (Úpravy). Nyní lze reakce přidávat kliknutím kdekoli na mapě a výběrem požadované reakce z rozbalovací nabídky. Textové vstupní pole lze použít k vyhledání reakce, která vás zajímá.
Abychom uvedli příklad výzkumné hypotézy, kterou lze testovat pomocí Escher-FBA, načetli jsme modely E. coli v měřítku genomu obsahující dvě cesty k výrobě 1-propanolu pro chemickou výrobu. Tyto cesty byly nedávno analyzovány ve studii o prediktivní síle modelů v měřítku genomu pro simulaci skutečných kmenů mikrobiálních buněčných továren . První model zahrnuje jedinou cestu k výrobě 1-propanolu (doplňkový soubor 1), kterou poprvé uvedli Atsumi et al . Druhý model zahrnuje dvě synergické cesty k produkci 1-propanolu (doplňkový soubor 2), které poprvé uvedli Shen a Liao . Každý model lze načíst samostatně (pomocí tlačítka nabídky Model > Load COBRA model JSON) a je k dispozici jediná mapa centrálního metabolismu, která je kompatibilní s oběma modely (Doplňkový soubor 3, lze načíst pomocí Map > Load Map JSON).
Zajímalo nás, zda synergický přístup k výrobě 1-propanolu – o němž je známo, že má vyšší výtěžnost produkce – má také rozdíl v požadovaném využití dráhy. Proto jsme načetli každý model zvlášť, maximalizovali jsme vylučování 1-propanolu (najeli jsme na EX_1poh_e a klikli na tlačítko Maximize), nastavili spodní hranici pro vylučování na 99 % maxima a poté minimalizovali tok přes první angažovaný krok pentózofosfátové dráhy, glukózo-6-fosfát dehydrogenázu (G6PDH2r). Výsledné mapy ukazují, že synergické dráhy pro produkci 1-propanolu jsou stechiometricky vyvážené s glykolýzou, takže nevyžadují aktivitu PPP (obr. 3b). Naproti tomu individuální dráha vyžaduje významný tok PPP (obr. 3a). Na těchto mapách lze také zkoumat další využití dráhy, například potřebný tok TCA pro jednotlivé případy.
Využití dráhy pro dvě heterologní cesty k produkci 1-propanolu v E. coli. Tok pentózofosfátové cesty (PPP) potřebný pro každou heterologní výrobní cestu lze porovnat tak, že za prvé vynutíme produkci 1-propanolu na 99 % maximální hodnoty (nastavením dolní hranice reakce výměny 1-propanolu) a za druhé minimalizujeme tok přes první krok PPP. (a) Cesta 1-propanolu, kterou uvádí Atsumi et al., využívá jedinou cestu k dosažení produkce 1-propanolu. Vyžaduje značný tok PPP a má nižší celkový výtěžek. (b) Cesta, kterou uvádějí Shen a Liao, využívá synergicky dvě cesty k dosažení vyššího výtěžku. Dráha je stechiometricky vyvážená s glykolýzou, takže nevyžaduje žádný tok PPP
Ačkoli Escher-FBA lze již použít pro mnoho simulací FBA přímo ve webovém prohlížeči, řadu příkladů, které uvádí Orth a kol. nelze v současné době pomocí Escher-FBA provést . V současné době Escher-FBA nemůže provádět funkce, jako je analýza vyřazení genů nebo analýza robustnosti. Escher-FBA však využívá flexibilní reprezentace SVG pro vizuální prvky, takže by bylo možné přidat analýzu robustnosti a dokonce i grafické funkce, jako jsou fázové roviny. Pro Escher-FBA jsme vytvořili plán vývoje (dostupný na domovské stránce https://sbrg.github.io/escher-fba) a iterativní proces vývoje, který má nakonec umožnit komplexní analýzu biologie systémů ve webovém prohlížeči
.