Tabulka 1
Excitace, emise a jas
Pokud plánujete použít více fluorescenčních značek, je důležité vybrat takovou, která má výrazné emisní píky – a také excitační píky, na které můžete zaměřit dostupné lasery. Pokud se emisní píky překrývají, bude obtížné nebo možná nemožné je rozlišit.
Obvykle chcete nejjasnější fluorescenční značku v rámci vašich dostupných spekter, abyste dosáhli jasného signálu a překonali případnou fluorescenci pozadí. Hodnoty jasu jsou součinem extinkčního koeficientu proteinu a kvantového výtěžku. Výsledné číslo však může být obtížně interpretovatelné, proto je běžným alternativním měřítkem jas fluorescenční značky ve vztahu k dobře definované značce, jako je EGFP.
Zrání a bělení
Zrání definuje, za jak dlouho se fluorescenční značka správně složí, vytvoří chromofor a začne fluoreskovat. Pro časově citlivé události v živých buňkách může být krátká doba zrání důležitá. Například superfolder GFP (sfGFP) se může složit za méně než 10 minut, zatímco mOrange to může trvat více než čtyři hodiny.
Vyblednutí je mírou fotostability, tj. jak dlouho po excitaci chromofor ztrácí schopnost vyzařovat světlo. Pokud plánujete provádět dlouhé časosběrné experimenty, zvažte značku s vysokou fotostabilitou. T-sapphire má poločas bělení (t½; doba, za kterou se počáteční rychlost emise x fotonů/s sníží na polovinu) 25 sekund, ale EGFP je mnohem stabilnější, s poločasem bělení t½ 174 sekund.
Podmínky prostředí
Stejně jako většina proteinů jsou fluorescenční značky ovlivněny pH, teplotou a hladinou kyslíku. V závislosti na prostředí, které plánujete použít, může být nutné buď mírně upravit podmínky, nebo zvolit vhodnější značku.
Ph může ovlivnit excitační a emisní píky a většina fluorescenčních značek je citlivá na kyseliny: některé mohou dokonce měnit intenzitu fluorescence při změně pH (např. pHTomato). Hodnota pKa je dobrým ukazatelem citlivosti na pH, protože ukazuje pH, při kterém fluoreskuje polovina chromoforů.
Dále teplota a hladina kyslíku ovlivňují dobu zrání: hypoxické podmínky mají tendenci zpožďovat dobu zrání, stejně jako teploty mimo optimální rozsah fluorescenčních značek (např. EGFP byl optimalizován pro práci při 37 °C). Novější fluorescenční značky, jako je UnaG, GFP izolovaný z japonského sladkovodního úhoře (Anguilla japonica), však fluoreskují i při nízké hladině kyslíku3.
Optimalizace kodonů
Jelikož většina fluorescenčních značek pochází z proteinů medúz nebo korálů, a nikoli z něčeho podobného, jako jsou savčí buňky a tkáně, v nichž je pravděpodobně použijete, může existovat mezidruhový rozdíl v použitých kodonech aminokyselin. To může vést ke špatné expresi, a tudíž k nízkému signálu.
Naštěstí bylo mnoho novějších verzí fluorescenčních značek kodonově optimalizováno tak, aby odrážely preference savčích buněk. Například u GFP Jürgen Haas a jeho kolegové zlepšili signál 40-120krát úpravou kodonové sekvence GFP4.
Používáte-li k vytvoření fúzních proteinů starší plazmid, nemusí obsahovat upravenou sekvenci fluorescenční značky. Proto vždy zkontrolujte, zda vaše sekvence nebyla upravena pro použití u určitého druhu.
Oligomerizace
Je důležité určit, zda je vaše značka monomer nebo dimer (monomery se obvykle označují předponou „m“ před názvem proteinu, např. mCherry) a zda to ovlivní váš experiment. Mnoho prvních fluorescenčních značek mělo sklon vytvářet oligomery a oligomerizace může ovlivnit biologickou funkci fúzního proteinu. Například EGFP je monomer, který může při použití v dostatečně vysokých koncentracích tvořit dimery, což může narušit subcelulární organely5 nebo narušit experimenty, jako je FRET6. V naprosté většině případů se doporučují skutečně monomerní FP.
GFP a mCherry produkty
.