Jednomolekulární koimunoprecipitační analýzy v reálném čase odhalují dynamiku nádorově specifické signalizace Ras

Zobrazování jednomolekulární koimunoprecipitace v reálném čase

Nejprve ukazujeme, že kinetiku interakce protein-protein lze měřit v buněčných extraktech na úrovni jedné molekuly (obr. 1). Jako modelovou interakci v buněčné signální dráze jsme zvolili interakci mezi Ras a Raf, která je počátečním krokem konzervované dráhy MAPK, jež je hyperaktivována u mnoha lidských nádorů5,6,7. V tomto případě jsme se zaměřili na interakci mezi Ras a Raf. Použili jsme Ras-vazebnou doménu cRaf (cRafRBD) a verzi HRas obsahující jednobodovou mutaci Q61L, která ji činí konstitutivně aktivní6,8,9,10,11,12 . Zobrazení živých buněk HeLa buněk koexprimujících tyto dva proteiny ukázalo vysokou úroveň kolokace (obr. 1a a doplňkový obr. S2). Tuto kolokaci se nám podařilo usměrnit pomocí rapamycinem spouštěné translokace HRas do plazmatické membrány13 , což vedlo k současné lokalizaci cRafRBD do stejných míst. Konvenční co-IP také vytvořila zřetelný westernový pás, což naznačuje selektivní protein-proteinovou interakci mezi konstitutivně aktivním HRas a cRafRBD (obr. 1b, vlevo). Zjistili jsme však, že tento zdánlivě jasný proteinový proužek obsahoval pouze méně než 5 % všech prey proteinů, což naznačuje, že prey proteiny nemusely být stabilně navázány na návnady, ale odstraněny do průtočné části prostřednictvím promývacích procesů (obr. 1b, vpravo a doplňkový obr. S3). Dále poznamenáváme, že oba přístupy zobrazování živých buněk a co-IP nemohou rozklíčovat skutečnou kinetiku této možná slabé, přechodné interakce protein-protein.

(a) Studie kolokace živých buněk pro interakci HRas-cRafRBD. Protein-proteinové interakce mezi HRas a cRafRBD byly hodnoceny pozorováním translokace cRafRBD do plazmatické membrány spolu s HRas. CA a DN označují konstitutivně aktivní a dominantně negativní formu HRas. Měřítko 10 μm. (b) Konvenční data co-IP pro interakci HRas-cRafRBD. Pro analýzy co-IP byly jako návnady imobilizované na kuličkách použity proteiny GST-cRafRBD (vlevo) a mCherry-HRas (vpravo). (c) Schéma jednomolekulové co-IP v reálném čase. (d) TIRF obraz imobilizovaného mCherry-HRas na povrchu. Měřítko 10 μm. (e) Po sobě jdoucí snímky ze zobrazování jednomolekulového co-IP v reálném čase. Sled těchto vazebných událostí v reálném čase je zobrazen v bodě f a označen červeným čtvercem. Měřítko 1 μm. (f,g) Příklady stop v reálném čase z jednomolekulového snímání co-IP v reálném čase. Signál se skládá především z difúzní fluorescence na pozadí překryté sekvencí fluorescenčních hrotů. (h) Negativní kontrolní experiment s povrchově imobilizovaným DN HRas (S17N). (i) Distribuce kbind pro experiment v bodě f. Příslušné kinetické rychlosti byly určeny pomocí fitování jednoexponenciální křivky (plné čáry). (j) Druhý negativní kontrolní experiment s povrchově imobilizovaným FLAG-eGFP. (k) Distribuce kdiss pro experiment v bodě f a kblinking pro experiment v bodě j. Příslušné kinetické rychlosti byly určeny pomocí fitování jednoexponenciální křivky (plné čáry). Chybové úsečky označují standardní chybu (s.e.; n>200).

Pro vizualizaci interakce HRas-cRafRBD v reálném čase na úrovni jedné molekuly jsme fúzovali gen HRas s červeným fluorescenčním proteinem mCherry a fúzovali jsme cRafRBD s rozšířeným zeleným fluorescenčním proteinem (eGFP; obr. 1c). Každý protein jsme exprimovali v samostatné skupině buněk HEK293. K imobilizaci mCherry-HRas na povrchu jsme použili strategii single-molecule pull-down2,3 (obr. 1c). Poté jsme na imobilizovaný povrch mCherry-HRas vstříkli druhý celobuněčný lyzát obsahující eGFP-cRafRBD jako při konvenčním co-IP (obr. 1c). Pomocí mikroskopu s totálním vnitřním odrazem (TIR) jsme vytvořili evanescentní elektrické pole, které selektivně excitovalo eGFP-cRafRBD, které se přiblížily na 100 nm od povrchu. Pro pozorování slabých interakcí protein-protein byly jednotlivé příchody eGFP-cRafRBD na povrch sledovány v reálném čase s druhým celobuněčným lyzátem udržovaným v komůrce (obr. 1c).

Obr. 1f ukazuje typickou stopu této přípravy co-IP s jednou molekulou v reálném čase. Každá stopa byla vytvořena integrací fluorescenčního signálu přes kruhovou oblast zájmu (ROI) o ploše 1,1 μm2 (obr. 1e). Řídili jsme povrchovou hustotu mCherry-HRas tak, abychom udržovali průměr 0,5 molekuly HRas na ROI (doplňkový obr. S4). Při integraci signálu jsme také použili Gaussovu filtraci a přísný práh pro detekci signálu, abychom zajistili, že stopy v reálném čase zaznamenávají vazebné události jednotlivých proteinů HRas (obr. 1g a doplňkový obr. S5). Každá stopa v reálném čase se zřetelně skládá ze dvou částí: fluorescenčního pozadí a jednotlivých fluorescenčních špiček. Každá molekula eGFP-cRafRBD, která se pohybuje podle Brownova pohybu, by měla strávit méně než 50 μs při jedné návštěvě excitační vrstvy TIR. Protože 50 μs je o tři řády kratší doba než časové rozlišení našeho zobrazovacího přístroje (50 ms), Brownův pohyb mnoha molekul eGFP-cRafRBD vytváří konstantní úroveň fluorescence pozadí. Jednotlivé hroty fluorescence naproti tomu naznačují, že jediný eGFP-cRafRBD interagoval s molekulou na povrchu dostatečně dlouho na to, aby přežil integraci signálu 50 ms.

Příště jsme analyzovali základní kinetiku této interakce protein-protein analýzou τoff, doby mezi vazebnými událostmi, a τon, doby trvání jedné vazebné události (obr. 1g). Dosazením jednoduchých exponenciálních rovnic do rozdělení τoff a τon získáme kinetické rychlosti kbind, resp. kdiss. Abychom se ujistili, že hroty fluorescence jsou skutečně výsledkem specifické interakce HRas-cRafRBD, provedli jsme stejný vazebný experiment eGFP-cRafRBD s povrchově imobilizovaným dominantně negativním HRas (S17N), který má sníženou afinitu ke GTP14,15 . U dominantně negativní formy se frekvence fluorescenčních hrotů (kbind) výrazně snížila (obr. 1h). Tato negativní kontrola dokazuje, že fluorescenční hroty nejsou ani artefakty prosté povrchové adsorpce eGFP-cRafRBD, ani nejsou způsobeny povrchovou imobilizací jiných proteinů s falešnými interakcemi eGFP-cRafRBD. Místo toho tyto fluorescenční hroty věrně informují o vazebných událostech HRas-cRafRBD.

Je také pozoruhodné, že trvání jedné vazebné události obvykle trvá jen několik set ms (obr. 1f). Studovali jsme dynamiku blikání FLAG-eGFP16 imobilizovaného na povrch pomocí protilátky anti-FLAG (obr. 1j). K fotoblikání FLAG-eGFP dochází v průměru každých několik sekund, což dává kinetickou rychlost menší než 0,3 s-1 a tato rychlost fotoblikání eGFP je o jeden řád pomalejší než námi naměřený kdiss (obr. 1k). Navíc jsme všechny jednomolekulární kinetické rychlosti kbind a kdiss znovu ověřili pomocí kritéria kolokace, které vyžaduje kolokaci fluorescenčních signálů z proteinů mCherry-HRas a eGFP-cRafRBD (doplňkový obr. S6). Interakce HRas-cRafRBD tedy musí mít skutečně rychlý obrat, několikrát za sekundu11,12.

Vizualizace encounterových komplexů v interakci Ras-Raf

Podrobná analýza frekvence vazby HRas-cRafRBD (kbind) naznačuje existenci rychlých preekvilibračních encounterových komplexů17,18,19,20,21, což jsou volné meziprodukty interakce protein-protein, které by měly být zaplněny před vytvořením konečného komplexu HRas-cRafRBD (obr. 2). Když jsme zvýšili koncentraci eGFP-cRafRBD z 5 na 50 nM, kbind vykazoval parabolický nárůst (obr. 2a), který lze nejlépe přizpůsobit rovnici s Hillovým koeficientem (n) 1,1 (22,23), disociační konstantou (K1) 43 nM pro tvorbu encounterového komplexu a κon 2.16 s-1 nM-1, což je kinetická rychlost tvorby konečného vázaného stavu z encounter komplexu (Supplementary Methods a Supplementary Fig. S7). kdiss je naopak pro námi studované koncentrace eGFP-cRafRBD do značné míry konstantní (obr. 2b). Tyto kinetické rychlosti naměřené pomocí našeho single-molecule co-IP v reálném čase jsou v úzkém souladu s předchozími zprávami používajícími objemové biochemické testy (Doplňková tabulka S1). Jedna poznámka se týká toho, že jsme předpokládali jednu převládající konformaci pro konečný komplex HRas-cRafRBD. Ačkoli náš předpoklad potvrzuje unimodální rozložení intenzity fluorescenčního hrotu (doplňkový obr. S8), nemůžeme zcela vyloučit možnost, že existuje více konformací komplexu HRas-cRafRBD s více cestami, které k nim vedou.

(a) kbind jako funkce koncentrace cRafRBD. Pro srovnání je zobrazen lineární nárůst kbind. (b) kdiss jako funkce koncentrace cRafRBD. kblinking z experimentu na obr. 1j je zobrazen pro srovnání. Chybové úsečky označují s.e. (n>180). (c-e) Sledování interakce HRas-cRafRBD v reálném čase. Všimněte si, že fluorescence pozadí se zvyšuje s hustotou HRas na povrchu. Použili jsme stejnou koncentraci kořisti =10 nM. (f) Nárůst fluorescence pozadí v závislosti na hustotě HRas na povrchu. Tři soubory dat získané s 10 nM (červené kruhy), 20 nM (zelené trojúhelníky) eGFP-cRafRBD a 20 nM rekombinantního eGFP (modré kosočtverce) jsou normalizovány odpovídající úrovní fluorescence pozadí naměřenou při nízké hustotě Ras na povrchu 0,38 HRas na μm2. Chybové úsečky označují s.d. (n>100). (g) Frekvence jednomolekulových hrotů jako funkce fluorescence pozadí. Je použit soubor dat získaný s 10 nM eGFP-cRafRBD. Chybové úsečky označují s.e. (n>100).

Pozoruhodné je, že setkávací komplexy můžeme zviditelnit změnou povrchové hustoty HRas. Pokud by fluorescence pozadí byla prostým produktem Brownova pohybu eGFP-cRafRBD, závisela by pouze na objemové koncentraci cRafRBD. Fluorescence pozadí však strmě roste s povrchovou hustotou HRas, i když je koncentrace cRafRBD konstantní (obr. 2c-f). Při vysoké hustotě Ras 6,4 HRas na μm2 je celková fluorescence pozadí třikrát vyšší než fluorescence pozorovaná při 0,38 HRas na μm2 (obr. 2c). Naše numerická simulace ukazuje, že přítomnost paralelních vazebných procesů v daném ROI může odpovídat pouze za méně než 5 % pozorovaného nárůstu (doplňkový obr. S9). Navíc když byly prey proteiny změněny na rekombinantní eGFP, které neinteragovaly s povrchově imobilizovanými HRas proteiny, jejich fluorescence na pozadí byla v podstatě neměnná v námi studovaném rozsahu hustoty HRas (obr. 2f, modré diamanty). Protože tedy máme na povrchu hustou populaci aktivních HRas, zdá se, že nad povrchem se skutečně zdržuje více molekul eGFP-cRafRBD, než by se dalo očekávat čistě Brownovou difuzí. Tyto encounterové komplexy vznikají v důsledku rychlých preekvilibračních interakcí mezi proteiny HRas a cRafRBD24 , jejichž dynamika je mimo naše časové rozlišení.

Nás dále zajímalo, zda encounterové komplexy skutečně slouží jako substráty pro konečný komplex HRas-cRafRBD. Za tímto účelem jsme hodnotili frekvenci fluorescenčních hrotů generovaných jedním povrchově imobilizovaným proteinem HRas. Usoudili jsme, že pokud jsou encounterové komplexy skutečnými meziprodukty na cestě pro konečný komplex Ras-Raf, měla by frekvence jednomolekulových hrotů růst s rostoucí fluorescencí pozadí navzdory stejné objemové koncentraci cRafRBD. Abychom získali frekvenci jednomolekulových hrotů v prostředí s hustým výskytem HRas, měřili jsme kbind pomocí menšího ROI o velikosti 3 x 3 pixely (0,18 μm2) a naměřenou hodnotu kbind jsme vydělili průměrným počtem HRas v každém ROI o velikosti 3 x 3 pixely (doplňkový obr. S10). Zjednodušeně řečeno, tato frekvence jednomolekulových hrotů se zvyšovala s fluorescencí pozadí (obr. 2g, použito 10 nM eGFP-cRafRBD). Naše pozorování naznačuje, že koncentrované downstream proteiny ve formě encounterových komplexů vedou ke vzniku komplexu Ras-Raf se zvýšenou frekvencí.

Jednomolekulová co-IP analýza signálních proteinů v rakovině

Dosud jsme prokázali měření kinetiky interakce protein-protein v reálném čase během jednomolekulové co-IP. V těchto experimentech jsou však proteiny návnady a kořisti spojeny s fluorescenčními proteinovými značkami, což vyvolává otázku, zda můžeme tuto techniku rozšířit na nativní proteiny. Za tímto účelem jsme exprimovali mutovaný HRas (G12V) v nenádorové linii lidských epiteliálních buněk prsu (MCF10A), abychom je přeměnili na nádorové buňky25 (obr. 3a). Tyto transformované buňky, které vykazovaly růst bez použití séra (doplňkový obr. S11), vytvořily nádory po injekci do prsního tukového polštářku imunokompromitovaných myší (obr. 3b). Nádorové tkáně byly získány 17 dní po xenotransplantaci a kontrolní tkáně byly připraveny ze stejných částí neošetřených nahých myší

(a,b) Transformace buněk MCF10A na nádorové buňky pomocí retrovirové transdukce HRas (G12V). Tato jednobodová mutace je známá tím, že činí HRas konstitutivně aktivní. Injekce rakovinných buněk do prsního polštářku nahých myší vede k tvorbě nádoru. Měřítko 5 mm. (c) Schéma analýzy Western blot s jednou molekulou. Konkurence mezi buněčným a sondovým Ras o vazbu na primární protilátku snižuje počet sondových Ras specificky navázaných na povrch, což následně snižuje počet fluorescenčních skvrn. Všimněte si, že jelikož se každá primární protilátka váže na dva proteiny Ras, jedna fluorescenční skvrna zmizí, když jsou obě dvě ramena lehkého řetězce obsazena buněčným Ras. (d) Prototypové měření Western blotu s jednou molekulou. Jako cílový protein bylo použito 298 nM mCherry-HRas. S 32,5 nM eGFP-HRas jako sondou byla naměřena koncentrace cílového proteinu 288±1,4 nM. Chybová úsečka označuje s.d. (n=20). (e) Hladiny exprese Ras měřené v průběhu procesu nádorového bujení z a,b. Chybové úsečky označují s.d. (n=20). (f) Schéma zobrazování co-IP v reálném čase pro nativní HRas. (g-j) Záznamy co-IP zobrazování v reálném čase. Koncentrace HRas použité pro pull down jsou 3,0 (g), 41,3 (h), 3,5 (i) a 49 nM (j). Frekvence fluorescenčních hrotů se významně zvýšila u extraktu z nádorové tkáně, když bylo stahování HRas zvýšeno z 1,6 na 22 HRas na μm2 (g versus h). U kontrolního tkáňového extraktu to nebylo pozorováno (i versus j). (k) Schéma inflace kbind. Za podmínek řídkého výskytu aktivních návnad na povrchu je dosaženo konstantního, jednomolekulového kbind, i když se zvýší povrchové stahování návnad (levé dva panely). Za prahovou hodnotou 0,6 aktivních návnad na μm2 je však v průměru přítomna více než jedna návnada na ROI. Tyto vícenásobné návnady mají za následek zvýšení kbind měřeného z každé ROI (pravý panel). (l) kbind jako funkce stahování HRas. Chybové úsečky označují s.e. (n>180).

Ve snaze popsat tuto nádorovitost kvantitativně jsme použili tandemové vrstvy protilátek; povrchově imobilizovanou biotinylovanou sekundární protilátku a primární protilátku specifickou pro Ras1,2 . To umožnilo zachytit nativní, neznačený Ras i značený Ras (obr. 3c). Nejprve jsme kvantitativně sledovali hladiny exprese Ras v průběhu procesu nádorového bujení. Buněčné nebo tkáňové extrakty byly smíchány se zředěným buněčným lyzátem HEK293, který obsahoval sondu Ras (eGFP-HRas) o známé koncentraci. Za reakčních podmínek, které plně nasytí vazebná místa primární protilátky, vede toto míchání k soutěži o vazbu Ras-specifické protilátky mezi sondou Ras a cílovým buněčným Ras (obr. 3c, vlevo). Počet molekul sondového Ras navázaných na primární protilátky klesá s rostoucí koncentrací cílového buněčného Ras. Tato kompetitivní vazba snižuje počet fluorescenčních skvrn na povrchu (obr. 3c, vpravo), který se při normalizaci na podmínku vazby pouze sondy Ras řídí rovnicí (doplňkový obr. S12). Měřením počtu navázaných molekul sondy při několika různých ředěních jsme byli schopni specificky a robustně měřit molární koncentraci cílového buněčného Ras v buněčných a tkáňových extraktech (obr. 3d a doplňkový obr. S12). Tato jednomolekulární analýza Western blot ukázala hladiny exprese Ras 42 a 59 nM v 1 mg ml-1 extraktů rakovinných buněk MCF10A a xenotransplantované nádorové tkáně, zatímco v 1 mg ml-1 extraktů kontrolní tkáně byla naměřena základní hladina 7 nM (obr. 3e).

Na tomto nativním povrchu zachycujícím Ras se nám navíc podařilo zopakovat jednomolekulární co-IP zobrazování v reálném čase z obr. 1 a 2. Na tomto nativním povrchu zachycujícím Ras se nám také podařilo zopakovat jednomolekulární co-IP. Po stažení HRas z nádorových nebo kontrolních tkáňových extraktů na tandemový povrch protilátek jsme aplikovali buněčný lyzát sondy, zředěný buněčný lyzát HEK293 s 20 nM prey proteinů eGFP-cRafRBD (obr. 3f). Analýzou stop co-IP v reálném čase jsme určili kinetické rychlosti kbind a kdiss (obr. 3g-j). Je důležité poznamenat, že informace o koncentraci z jednomolekulární analýzy western blotu (obr. 3e) byla klíčová pro zajištění stanovené koncentrace HRas pro každý pull down, když extrakty nádorové a kontrolní tkáně měly rozdílné úrovně exprese HRas. Pomocí kalibračních dat pro povrchové stahování (Doplňkový obr. S13) byla informace o koncentraci nakonec převedena na specifickou povrchovou hustotu stahovaných proteinů HRas (obr. 3g-j).

Systematicky jsme studovali změnu kbind při přesném zvyšování povrchové hustoty stahovaných proteinů HRas (obr. 3k). Předpokládáme, že v důsledku buněčné regulace by měla být pouze podmnožina proteinů HRas na povrchu ve stavu nabitém GTP a vykazovat aktivní vazebné události s kořistními proteiny. Za řídkých podmínek, kdy je vzdálenost mezi sousedními aktivními molekulami HRas mnohem větší než průměr každého ROI, by pozorovaná kinetika z každého ROI měla být nezávislá na celkové imobilizaci HRas na povrchu a jednoduše informovat o aktivitě jednotlivých proteinů HRas (obr. 3k, levé dva panely a doplňkový obr. S14). Jak se povrch zahlcuje aktivními HRas, měl by existovat práh, při kterém začne být v každém ROI více než jedna aktivní molekula HRas. Po překročení tohoto prahu by další aktivní molekuly HRas v každém ROI vytvářely další fluorescenční hroty, které by následně nafoukly kbind (obr. 3k, pravý panel a doplňkový obr. S14). Skutečně jsme pozorovali takovýto bifázický trend kbind pro nádorovou tkáň s prahem při ~3 stažených HRas na μm2 (obr. 3l).

Pod prahem pro nafukování kbind by tedy pozorovaná kinetika hrotů z velké části odrážela aktivitu jednotlivých molekul HRas. Pozoruhodné je, že při 1,6-1,9 HRas stažených na μm2 byly pozorovány podobné hodnoty kbind 0,28 s-1 a 0,22 s-1 pro proteiny HRas odvozené z nádorové a kontrolní tkáně (obr. 3l). Měření kdiss byla rovněž velmi podobná při 2,5 s-1 (doplňkový obr. S15). Jednoduchý onkogenní HRas odvozený z nádoru měl následně zdánlivou disociační konstantu 180 nM a ta byla velmi podobná disociační konstantě 230 nM pro aktivní HRas z kontrolního tkáňového extraktu. Naše pozorování naznačují zásadní skutečnost, že jednomolekulární aktivita onkogenní HRas se nijak dramaticky neliší od aktivity aktivované HRas divokého typu.

Co tedy odlišuje tento nádorový stav od normálního? Práh inflace kbind nám umožňuje kvantifikovat další důležitou statistiku buněčných signálních proteinů, podíl proteinů HRas aktivně se vážících s cRafRBD. Intuitivně by práh pro inflaci kbind měl odpovídat určité povrchové hustotě „aktivních“ návnadových proteinů. V našem zobrazovacím schématu bylo zjištěno, že tento práh je na úrovni 0,6 aktivních návnad na μm2 , což nezávisí na detailních typech návnadových a kořistních proteinů (doplňkový obr. S13). Vzhledem k tomu, že prahová hodnota pro inflaci kbind byla pozorována při celkovém počtu 3 HRas stažených na μm2 , byla frakce aktivních HRas přímo odhadnuta na přibližně 20 % pro nádorovou tkáň. Naproti tomu jsme nebyli schopni pozorovat inflaci kbind, když bylo z kontrolní tkáně staženo dokonce 25 proteinů HRas na μm2 (obr. 3l). Tato pozorování naznačují, že onkogenní HRas pocházející z nádorové tkáně má o řád vyšší aktivní podíl než HRas pocházející z kontrolní tkáně.

Nakonec jsme si položili otázku, zda tento vyšší podíl aktivního Ras nemůže být prostým důsledkem nadměrné exprese HRas v xenotransplantovaném nádoru. Nadměrně exprimované proteiny HRas by mohly převyšovat počet předpokládaných vazebných partnerů, kteří zůstávají k dispozici pro vazbu s Raf značeným eGFP. Abychom tuto otázku přímo zodpověděli, testovali jsme dvě lidské buněčné linie karcinomu prsu, MCF-7, která má divoký typ KRas, a MDA-MB-231, která má mutantní formu KRas (G13D; obr. 4). Je známo, že zejména buňky MDA-MB-231 vykazují závislost na onkogenu mutovaného genu KRas a jejich přežití kriticky závisí na aberantní signalizaci KRas26,27 . Pomocí těchto dvou buněčných linií jsme také schopni zjistit, zda se naše metody vztahují na signalizaci KRas, která má klíčový význam v molekulární diagnostice a léčbě mnoha lidských nádorů28.

(a,b) Jednomolekulární western blot analýzy hladiny exprese KRas. eGFP značený KRas byl použit jako sonda Ras. Hladina exprese divokého typu KRas v linii MCF-7 byla naměřena 17,3±1,3 nM, zatímco hladina exprese mutantního KRas G13D v linii MDA-MB-231 byla naměřena 5,5±0,3 nM na 1 mg ml-1 extraktu. Chybové úsečky označují s.d. (n=200). (c) kbind jako funkce stahování KRas. Všimněte si stejné hodnoty kbind, kterou sdílí divoký typ a mutantní KRas v oblasti kinetiky jedné molekuly (společná plochá čára). Pro mutantní KRas z MDA-MB-231 byla naměřena prahová hodnota kbind na úrovni 1,2 staženého KRas na μm2 , což dává odhadovanou aktivní frakci 50 %. Tato hodnota byla o jeden řád vyšší než 6 % divokého typu KRas z MCF-7, u kterého byla prahová hodnota 10 KRas stažených na μm2. Chybové úsečky označují s.e. (n>150).

Přímo jsme stáhli KRas z těchto buněčných extraktů pomocí primární protilátky specifické pro KRas. Naše jednomolekulární analýza western blot ukázala, že divoký typ KRas v buňkách MCF-7 má vyšší koncentraci (17 nM) než mutantní KRas v buňkách MDA-MB-231 (5,5 nM v 1 mg ml-1 extraktu; obr. 4a a doplňkový obr. S16). Vzhledem k závislosti buněk MDA-MB-231 na onkogenu KRas byla jejich nižší úroveň exprese KRas poměrně nečekaným zjištěním. Kinetika signalizace v jedné molekule pro divoký typ a mutantní KRas je navíc v podstatě stejná (obr. 4c, společná rovná čára; kdiss viz doplňkový obr. S15). Na druhou stranu naše single-molecule co-IP v reálném čase řeší, že práh pro inflaci kbind pro mutantní KRas z MDA-MB-231 je identifikován na 1,2 KRas stažených na μm2, zatímco u divokého typu KRas z MCF-7 je tento práh pozorován na ~10 KRas stažených na μm2 (obr. 4c). Vzhledem k tomu, že k infiltraci kbind dochází vždy při 0,6 aktivních návnad na μm2, tyto rozdílné prahové hodnoty přímo naznačují, že aktivní frakce mutantní KRas, která se silně váže na svůj downstream cíl (15 nM cRafRBD), je 50 %, což je téměř o jeden řád více než 6 %, které vykazuje KRas divokého typu. Vyšší aktivní frakce, kterou vykazuje onkogenní mutantní Ras, tedy zjevně není artefaktem nadměrné exprese, protože mutantní KRas byl exprimován v nižších hladinách, ale vykazoval vyšší aktivní frakci než divoký typ

.