Katalyzátory štěpení řetězce DNA na apurinových/pyrimidinových místech

Sloučenina C1 může štěpit DNA obsahující AP místo

Počáteční pozorování, které naznačilo přítomnost neobvyklé aktivity u podskupiny zkoumaných malých molekul, bylo učiněno při testování C1 (obr. 1a) jako potenciálního inhibitoru hOGG1. Konkrétně přidání této sloučeniny k reakcím hOGG1 s fluorescenčně značeným duplexním oligodeoxynukleotidem obsahujícím místně specifický 8-oxo-dG adukt (obr. 1b) vedlo ke vzniku dalšího produktu, který migroval rychleji než β-eliminační produkt; samotný hOGG1 poskytoval pouze β-eliminační produkt (obr. 1c). Když byla DNA obsahující 8-oxo-dG inkubována pouze s C1, nebyly pozorovány žádné produkty s niklem.

DNA obsahující místo AP byla získána ošetřením odpovídající DNA obsahující dU pomocí UDG. (a) Struktura reprezentativního katalyzátoru pro štěpení DNA. (b) Substráty DNA. (c) Štěpení DNA obsahující 8-oxo-dG (250 nM) v přítomnosti hOGG1 (100 nM) a C1 (10 μM). (d) Štěpení DNA obsahující AP místo (250 nM) v přítomnosti hOGG1 (50 nM) a C1 (10 μM). (e) Štěpení DNA obsahující AP místo (250 nM) v přítomnosti hNEIL1 (50 nM) a C1 (10 μM). (f) Štěpení DNA obsahující místa AP (2 μM) pomocí C1. Procento produktů bylo korigováno na spontánní štěpení. Reakce probíhaly při 37 °C po dobu 30 min (b-d) nebo 16 h (e).

Předpokládalo se několik mechanistických možností, které by mohly vysvětlit vznik nového produktu. 1) V přítomnosti C1 získala hOGG1 kromě funkce glykosylázy a β-eliminační AP lyázy také schopnost katalyzovat δ-eliminační reakci; 2) C1 mohl převést β-eliminační produkt na δ-eliminační produkt a 3) místa AP, která vznikla při glykosylázové reakci, mohla sloužit jako substrát pro C1 katalyzovanou β,δ-eliminační reakci. Pro řešení těchto možností byla duplexní DNA obsahující jedno místo specifické pro AP vytvořena ošetřením odpovídající DNA obsahující dU uracil DNA glykosylasou (UDG) (obr. 1b) a reagovala s C1 nebo hOGG1, a to buď samostatně, nebo v kombinaci. Stejně jako u oligodeoxynukleotidu obsahujícího 8-oxo-dG vznikl při reakci s hOGG1 očekávaný β-eliminační produkt, zatímco při přidání C1 vznikla směs dvou produktů (obr. 1d). Tato směs produktů vznikla také při inkubaci oligodeoxynukleotidu obsahujícího AP se samotným C1. Zatímco poloha pomaleji migrujícího pásu produktu odpovídala β-eliminačnímu produktu hOGG1 (obr. 1d), rychleji migrující pás produktu ko-migroval se známým δ-eliminačním produktem hNEIL1 (obr. 1e). C1 tedy podporuje β- a δ-eliminační reakce v místech AP.

Štěpná reakce C1 na DNA obsahující místa AP byla závislá na koncentraci (obr. 1e a doplňkový obrázek S1), přičemž k pozorování produktů stačily nízké mikromolární koncentrace. Podobně jako dříve navržené „umělé nukleasy „26 vykazovala C1 na substrátu DNA katalýzu typu turn-over: C1 generovala ~1,4 pmol produktů za 16 h (obr. 1f). Rychlost řezání C1 na této DNA tedy byla ~1,5 × 10-3 min-1 nebo vyšší. Srovnání C1 s aktuálně dostupnými činidly AP lyasy sperminem17 a peptidem KWKK23 ukázalo, že nově identifikovaný katalyzátor je nejméně 100krát účinnější (doplňkový obr. S1).

Několik strukturních částí v C1 je pro katalýzu důležitých

Analogy C1 byly testovány za účelem stanovení příspěvku specifických strukturních vlastností k chemii štěpení vláken. Nejprve jsme zkoumali schopnost jednoduchých, komerčně dostupných aminů postrádajících indolinon-pyrrolovou část C2 (obr. 2) a CS1-CS3 (doplňkový obrázek S2) štěpit DNA v místě AP. Případná tvorba produktů řezu byla při koncentraci 10 μM pod úrovní detekce. Pro reakci je tedy důležitá indolinon-pyrrolová část. Je možné, že indolinon-pyrrolová podjednotka se váže na AP místo29 nebo minoritní drážku a umisťuje sekundární amin tak, aby katalyzoval štěpení vlákna prostřednictvím kovalentního meziproduktu s AP místem. Sloučeniny C3 (obr. 2) a CS4 (doplňkový obrázek S2), které obsahovaly indolinon-pyrrolovou část, ale postrádaly sekundární amin, byly rovněž zcela neaktivní. Tyto údaje silně naznačují roli aminu jako reaktivní funkční skupiny. Nahrazení methoxy skupiny na pyrrolu jinými substitucemi, například v C4 a C5 (obr. 2), vedlo ke snížení aktivity. Reakce byla také modulována substituentem na aminoskupině, takže zvýšení sterických nároků sekundárního aminu snížilo množství pozorovaného produktu (srovnej C1, C6 a C7 (obr. 2) a C4, CS5 a CS6 (doplňkový obrázek S2)). Tyto strukturně-aktivní analýzy ukázaly, že několik jednotlivých částí je pro štěpení nezbytných, ale nikoliv postačujících, a že tyto části musí působit kooperativně, aby došlo ke štěpení vlákna.

(a) Struktury reprezentativních sloučenin. (b) Substrát DNA. (c) Test na schopnost reprezentativních sloučenin (10 μM) nařezat DNA obsahující místo AP (250 nM). Reakce probíhaly při 37 °C po dobu 30 in.

Struktura DNA moduluje štěpení katalyzované C1

Důležitost indolinon-pyrrolové části pro chemii štěpení vláken naznačila, že struktura substrátu DNA by mohla ovlivnit štěpení zprostředkované C1. Pro řešení těchto vztahů byly měřeny počáteční reakční rychlosti pro jednořetězcovou DNA (sekvence jako na obr. 1a) a odpovídající dvouřetězcové DNA, které obsahovaly A, C, G nebo T naproti místu AP. Homopolymerní oligodeoxynukleotid, 5′-TAMRA-(T)5-AP-(T)11-3′, byl rovněž zkoumán jako jednoznačná struktura jednořetězcové DNA. Tato data ukázala, že ačkoli ke štěpení vláken může docházet v kontextu jednořetězcové DNA, dvouřetězcové DNA jsou mnohem preferovanějšími substráty pro C1 (obr. 3). Bylo také zjištěno, že povaha báze naproti AP místu moduluje katalýzu, přičemž rychlost hydrolýzy AP místa je rychlejší naproti pyrimidinům než purinům. Tato pozorování jsou v souladu s návrhem, že indolinon-pyrrolová podjednotka interaguje s DNA, aby obsadila prázdné místo v místě AP. Pozoruhodné je, že počáteční rychlost naměřená pro dvouřetězcovou DNA s C naproti místu AP byla velmi blízká rychlosti pozorované pro tento substrát za podmínek limitní koncentrace C1 (obr. 1f).

Reakce byly prováděny při 37 °C za použití 250 nM DNA a 5 μM C1. Průměrné počáteční rychlosti s příslušnými směrodatnými odchylkami byly vypočteny ze tří nezávislých experimentů pomocí softwaru KaleidaGraph 4.1 (Synergy Software). Hodnoty P byly vypočteny pomocí Studentsova t-testu.

Kleavace DNA v místech AP pomocí C1 probíhá prostřednictvím intermediátu zahrnujícího sekundární amin

Pro testování kovalentního intermediátu s kruhově otevřenou, aldehydickou formou deoxyribózy byl použit oligodeoxynukleotid obsahující místa AP značená 32P (obr. 1). 4a) byl inkubován s C1 v přítomnosti NaB(CN)H3. Tento reduktant sice pomalu reaguje s AP lézí, ale účinně zachycuje konjugát iminu nebo iminiového iontu. V kontrolní reakci s oligodeoxynukleotidem obsahujícím AP místo a NaB(CN)H3 (obr. 4b, dráha 5) se u malé části (~3 %) DNA projevila snížená pohyblivost. Tento produkt s nízkým obsahem je běžně pozorován v záchytných reakcích23 a pravděpodobně představuje komplex s molekulami Tris, jak bylo dříve prokázáno v reakcích s malondialdehydovým pyrimidopurinonovým aduktem DNA30. V pozitivní kontrolní reakci s použitím peptidu lysin-tryptofan-lysin-lysin (KWKK)23 byl zachycen iminový meziprodukt, jak dokládá posun v pohyblivosti DNA (obr. 4b, dráha 3). V přítomnosti NaB(CN)H3 a C1 tvořila většina DNA (~80 %) komplex, který se jevil jako druh se sníženou pohyblivostí (obr. 4b, pruh 4). Tvorba komplexu nebyla způsobena nespecifickou vazbou C1 na DNA, protože při testování odpovídajícího oligodeoxynukleotidu obsahujícího dU za stejných podmínek nebyl pozorován žádný posun (obr. 4b, pruh 1). Tyto údaje byly v souladu s hypotézou, že činidlo bylo schopno vytvořit kovalentní meziprodukt iminiového iontu, který pak umístí postranní skupinu pro abstrakci protonu z cukerného kruhu.

(a) substráty DNA. (b) Kyanoborohydridové zachycení komplexu mezi C1 a DNA obsahující místo AP. (c) CID fragmentace meziproduktu redukovaného iminiového iontu. (d) Fragmentace redukovaného konjugátu C1-deoxyribózy po enzymatickém štěpení.

Redukční záchyt C1 byl opakován s použitím neznačeného oligodeoxynukleotidu obsahujícího AP místo (obr. 4a) a produkt byl analyzován hmotnostní spektrometrií (MS). Analýza odhalila hmotnost odpovídající redukovanému kovalentnímu komplexu DNA-C1 (m/z 1134,64 pro -2). Srážkou indukovaná disociace (CID) tohoto iontu vedla ke kompletní sadě iontů a-B (báze) a w, což odpovídá redukovanému iminiovému iontu mezi C1 a místem AP (doplňkový obrázek S3). V sérii iontů a-B je fragmentace vazby C3′-O obvykle doprovázena neutrální ztrátou nukleobáze. Očekávalo se, že redukovaná vazba mezi C1 a místem AP bude méně labilní, a v důsledku toho jsme pozorovali ion a4 (m/z 1330,1) a také a4-B (m/z 1005,6). Oligodeoxynukleotid byl také enzymaticky štěpen a analyzován pomocí MS (obr. 4c a doplňkový obrázek S4). Byl pozorován produkt trávení s hmotností odpovídající redukovanému konjugátu C1-deoxyribózy (m/z 444,19); fragmentace tohoto produktového iontu dala dceřiný ion s m/z 295,09, který vznikl neutrální ztrátou N-methyl amino-2-deoxyribitolu (obr. 4d a doplňkový obrázek S4). Tento produkt byl totožný s produktem připraveným z reakce reduktivní aminace 2-deoxyribózy a C1. Tyto studie ukazují, že C1 štěpí DNA obsahující AP místo prostřednictvím kovalentní katalýzy za účasti sekundárního aminu.

C1 zvyšuje tepelnou stabilitu DNA obsahující analog AP místa

Vliv C1 byl studován na tepelnou stabilitu DNA obsahující tetrahydrofuran (THF), strukturní analog AP místa, který není schopen podstoupit β-eliminační reakci31. Tm duplexní DNA obsahující THF naproti T (T:THF) se po přidání 1 ekvivalentu C1 zvýšila o 6,3 °C, zatímco Tm kontrolní DNA obsahující pár T:A byla ovlivněna méně a zvýšila se pouze o 1 °C (obr. 5). Zatímco křivka tání T:THF s C1 naznačovala tepelnou stabilizaci C1, přítomnost C1 také rozšířila křivku tání, což naznačuje méně kooperativní přechod tání. Souhrnně tato pozorování naznačují, že C1 se specificky váže na DNA v místě AP a poskytuje lokalizovanou stabilizaci šroubovice DNA. To je v souladu s navrženým modelem interakcí mezi C1 a DNA, ve kterém indolinon-pyrrolová část zabírá prostor dostupný v místě AP.

Křivky teploty tání T:A (a) a T:THF (b) byly získány při použití 5 μM DNA v 10 mM fosforečnanovém pufru sodném, pH 7.0, 100 mM NaCl a 1 mM EDTA v nepřítomnosti (plná čára) a přítomnosti (čárkovaná čára) 5 μM C1.

C1 má vyšší afinitu k DNA obsahující místo AP

Za účelem prozkoumání způsobu vazby a afinity C1 k DNA obsahující místo AP byly provedeny analýzy cirkulárního dichroismu (CD) s použitím duplexních oligodeoxynukleotidů obsahujících THF i kontrolních T:A (obr. 6). Indukovaná CD (ICD) C1 při interakci s duplexem T:THF byla pozorována jako silný excitonový signál, bisignátního tvaru s pozitivními a negativními pásy vzhledem k absorpčnímu maximu volného C1. To obecně svědčí o tvorbě dimerních komplexů nebo komplexů vyššího řádu, a to buď v režimu vazby na drážky, nebo v režimu vazby na vnější stohování32. Titrace C1 se zvyšující se koncentrací T:THF (obr. 6a a doplňkový obrázek S5) odhalila jak nespecifické, tak specifické interakce. Na začátku titrace je C1 v nadbytku a upřednostňují se nespecifické interakce. Po přidání T:THF se ICD při ~488 nm zvýšila. Při koncentraci DNA přibližně 2 μM se pás ICD posunul k nižší energii (~ 495 nm) a poté se snížil až do bodu ekvivalence a při přebytku DNA dosáhl plató, což svědčí o specifické interakci. Titrace C1 s kontrolní T:A DNA (obr. 6a a doplňkový obrázek S5) nevykazovala pozitivní ICD kolem 495 nm, což naznačuje nepřítomnost specifických interakcí. Přední titrace T:THF rovněž vykazovala důkazy nespecifických a specifických interakcí (obr. 6b). Při nízkých koncentracích C1 s přebytkem DNA měl pás ICD střed při ~ 495 nm (specifický); s rostoucí koncentrací C1 vzhledem k DNA se intenzita ICD zvyšovala a posouvala k vyšší energii (~ 488 nm), což svědčí o nespecifické vazbě, jak se očekává při vysokých koncentracích ligandu. Pozorovaný hypochromní posun může naznačovat změnu nebo definovanější konformaci C1 při specifické vazbě na místo AP. Titrace kontrolní DNA bez místa AP rovněž ukázala ICD a důkaz nespecifické vazby (obr. 6c). Stojí za povšimnutí, že pás při 450-520 nm se objevil pouze při trojnásobném přebytku C1 vzhledem k DNA, takže tento rozsah vlnových délek byl nejlepší volbou pro konstrukci vazebných křivek. Vazebné izotermy byly konstruovány a analyzovány pomocí jednoduchého bimolekulárního vazebného modelu, jak bylo publikováno dříve32. Nelineární rovnice, které vyplynuly z 500 nm izoterm (obr. 6d), poskytly disociační konstantu (KD) 64 μM pro kontrolní T:A DNA (nespecifická vazba) a 29 μM pro T:THF DNA (specifická vazba); KD C1 s duplexem obsahujícím THF byla vypočtena na 22 μM po odečtení pro korekci příspěvku nespecifické vazby a možných interakcí ligand-ligand (tab. 1). Hodnoty KD vypočtené při 495 nm byly jen mírně mimo chyby hodnot vypočtených při 500 nm (tabulka 1).

(a) Titrační křivky intenzity ICD při 500 nm za použití konstantní koncentrace C1 (20 μM) a rostoucí koncentrace DNA (reverzní titrace). (b) CD spektra pro T:THF a (c) T:A s použitím konstantní koncentrace DNA (10 μM) a rostoucí koncentrace C1 (přímá titrace). (d) Titrační křivky intenzity ICD při 500 nm v závislosti na logaritmu koncentrace C1 pro T:THF a T:A (odvozené z údajů v panelech b a c). (e) Titrační křivky intenzity ICD při 500 nm v závislosti na logaritmu koncentrace C6 pro T:THF a T:A (odvozeno z údajů na doplňkovém obrázku S6). (d) Titrační křivky intenzity ICD při 500 nm versus logaritmus koncentrace C6 pro T:AP a T:A (odvozeno z údajů na doplňkovém obrázku S6).

Dále byla zvažována možnost, že by afinita C1 mohla být odlišná pro DNA obsahující přirozené místo AP místo THF. Abychom tuto otázku vyřešili, testovali jsme strukturně příbuznou, ale neaktivní sloučeninu C6 (obr. 2) v CD analýzách s DNA obsahující buď THF, nebo AP místo, které bylo vytvořeno z dU úpravou UDG. CD spektra pozorovaná pro C6 v dopředných titračních experimentech s použitím DNA T:THF a T:A (doplňkový obrázek S6) byla obecně podobná těm, která byla pozorována pro C1 (obr. 6b,c). Vazebné izotermy byly sestrojeny (obr. 6e) a analyzovány stejně jako výše. KD C6 s duplexem obsahujícím THF, korigovaná na nespecifické interakce, byla vypočtena na 28 μM (tab. 1), což je pouze o ~25 % vyšší než odpovídající KD vypočtená pro C1. C6 se tedy jeví jako vhodný model pro studium interakcí C1 s DNA. Poté byla provedena dopředná titrace C6 pomocí DNA, která obsahovala místo AP odvozené od UDG (doplňkový obrázek S6). Analýzy vazebných izoterem ukázaly, že afinita C6 k této DNA je v podstatě totožná s DNA obsahující THF (obr. 6f a tab. 1). Vzhledem k tomu, že deoxyribosa v přirozeném AP místě existuje převážně ve formě uzavřené do kruhu, podobné THF31 , nebyl tento druhý výsledek překvapivý. Lze předpokládat, že před vytvořením kovalentního meziproduktu bude afinita C1 k DNA obsahující místo AP srovnatelná s afinitou naměřenou pro DNA obsahující THF. Silnější vazba C1 na DNA obsahující AP místo ve srovnání s kontrolní DNA tedy odpovídala údajům o tepelné stabilitě a společně podporuje návrh, že indolinon-pyrrolová podjednotka obsazuje prázdný prostor v AP místě DNA. Je pravděpodobné, že afinita C1 k AP místu přispívá k jeho lyasové aktivitě a poskytuje jasnou výhodu oproti C2, CS1, CS2 a CS3, které postrádají indolinon-pyrrolovou část (obr. 2 a doplňkový obrázek S2).

Závěry

Katalyzátory štěpení AP vláken DNA popsané v této studii představují novou třídu sloučenin, které lze využít ke štěpení AP míst za fyziologických podmínek. Na základě této základní struktury lze navrhnout molekuly, které zlepší selektivitu štěpení AP míst naproti různým bázím a potenciálně pro různé sekvenční kontexty. Díky nedávnému pokroku ve vývoji vysoce výkonných screeningových technik by tyto sloučeniny mohly být rychle rozšířeny jako účinná činidla pro štěpení AP míst, která vznikají depurinací nebo cestou BER v buňkách a organismech. Optimalizované verze C1 mohou mít také terapeutické využití, zejména v kombinaci s mnoha běžnými protinádorovými léčivy, která buď poškozují DNA, jako jsou alkylační činidla33 , nebo se zaměřují na opravu DNA, jako jsou inhibitory PARP34,35 nebo AP endonukleázy36. Je třeba zmínit, že 3′ konce vytvořené β- nebo β,δ-eliminací nemohou být využity DNA polymerázami bez předchozí opravy37. Očekává se, že biologické důsledky přeměny míst AP na takové zlomy řetězce DNA budou komplexní a budou se lišit v závislosti na buněčné schopnosti opravovat nebo tolerovat různé typy poškození DNA. Mezi možné důsledky může patřit zvýšená terapeutická účinnost protinádorové léčby (účinnější zabíjení buněk) a snížení mutageneze vyvolané léky. Štěpení DNA v místech AP může být zvláště přínosné pro léčbu rakoviny, která má defekty v mechanismech opravy zlomů řetězce DNA, jako jsou rakoviny s deficitem BRCA34,35.

.