Kineticky omezená diferenciální centrifugace jako levná a snadno dostupná alternativa k odstředivé elutriaci

V mnoha aplikacích je požadována separace cílových buněk ze směsí obsahujících jiné buňky s podobnou hustotou, ale odlišnou velikostí (buď mírně, nebo podstatně). Příkladem je vytváření synchronizovaných buněčných kultur, kdy se izolují buňky v určité fázi jejich cyklu (charakterizované jejich velikostí) (1-2), izolace kortikotropů od jiných buněk hypofýzy (3) a třídění různých subpopulací monocytů (4). Metodou volby pro separaci buněčných populací na základě rozdílů v rychlosti sedimentace (zejména pokud rozdíly v hustotě nejsou významné) je proces zvaný centrifugální elutrace (5). Zde jsou separáty (obvykle buňky) vystaveny působení dvou sil: (i) odstředivé síle, která způsobuje, že sedimentují rychlostí, která je funkcí jejich hustoty a velikosti, a (ii) konvekčnímu proudění v opačném směru, které propůjčuje všem buňkám pevnou rychlost. Proudění a/nebo rychlost odstřeďování lze nastavit tak, aby se shromažďovaly pouze ty buňky, jejichž sedimentační rychlost spadá do určitého rozmezí. Tento postup byl sice úspěšně použit i k separaci bakteriálních buněk z matric, v nichž jsou přítomny (6) (aplikace našeho zájmu), ale potřeba specializovaného vybavení je pro mnoho laboratoří překážkou.

Přestože byla popsána řada protokolů pro izolaci bakterií z různých matric, jako jsou potraviny (7-8), půda (9) a mikrobiální rohože (10), které využívají snadno dostupné stolní odstředivky k oddělení buněk na základě různých rychlostí sedimentace, doporučené protokoly se často jeví jako ad hoc. Například Wang et al. (8) doporučují při izolaci bakterií z měkkého sýra centrifugaci při <1000×g po blíže nespecifikovanou dobu k odstranění zbytků, po níž následuje centrifugace při 9000×g po dobu 3 min ke sběru bakterií. Podobně pro izolaci bakterií z homogenizovaného masa doporučili Neiderhauser et al. (7) odstřeďování při 100×g (po nespecifikovanou dobu) k odstranění částic potravin a následné odstřeďování při 3000×g (opět po nespecifikovanou dobu) ke shromáždění bakterií. V jiných případech doporučené protokoly zahrnují více kol odstřeďování. Například Bey et al. (10) doporučují pro izolaci bakterií z mikrobiálních podložek nejen odstřeďování při 500×g po dobu 15 minut, ale také resuspenzi sedimentu a čtyřnásobné opakování postupu. Podobně Bakken (9) doporučuje pro izolaci bakterií z půdy opakovanou (na „několikrát“) centrifugaci homogenátu vzorku při 630-1060×g (po blíže nespecifikovanou dobu) a následnou resuspenzi a rehomogenizaci. Podobné postupy byly navrženy také pro izolaci bakterií z „pozitivního“ krevního kultivačního bujónu. K získání čistých izolátů bakterií před stanovením jejich identity pomocí hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF použili Stevenson et al. (11) vícestupňový postup centrifugace zahrnující postupné kroky centrifugace po dobu „1-2 minut“ při 8500, 1000 a 13 000 otáčkách za minutu (hodnota v g není specifikována) s resuspenzí peletu v různých pufrech v každém kroku.

Tyto citované protokoly nejsou zdaleka jedinými příklady ad hoc centrifugačních protokolů, které se vyznačují zjevně libovolnou volbou rychlosti a/nebo doby centrifugace. Důležitým důsledkem takových ad hoc protokolů je, že neposkytují žádný racionální základ, na jehož základě by ostatní mohli navrhnout protokoly pro izolaci různých cílových buněk z jiných matric/směsí buněk. Je například intuitivně zřejmé, že při delším odstřeďování se všechny částice usadí, zatímco při krátkodobém odstřeďování se usadí pouze nejrychlejší částice a většina pomalejších částic zůstane v suspenzi. Určení optimální rychlosti/délky odstřeďování pro izolaci cílových částic při současném vyloučení ostatních však zůstává spíše uměním. Jinými slovy, v současnosti uváděné protokoly neposkytují racionální základ pro modifikaci (stanovení optimální rychlosti/doby odstřeďování) pro další související cíle separace/izolace.

Materiály a metody

Teorie

Náš návrh metody separace dvou typů částic, které mají podobnou hustotu, ale rozdílnou rychlost sedimentace kvůli rozdílné velikosti, je znázorněn na obrázku 1. Na začátku procesu (Obrázek 1(1)) se suspenze (v našem případě vývar z krevních kultur) obsahující separáty (bílé krvinky neboli WBC, červené krvinky neboli RBC, krevní destičky a bakterie) vloží jako samostatná vrstva na průhledný hustý pufr (v našem případě Histopaque 1083). Hustota pufru je vyšší než hustota WBC (ρ = 1,06 – 1,08 g/ml (12)) a krevních destiček (ρ = 1,05 – 1,07 g/ml (13)), ale nižší než hustota RBC (ρ = 1,1 g/ml (14)) a bakterií (ρ = 1,105 g/ml pro Escherichia coli (15)). Při odstřeďování jsou všechny částice hnány dolů, nejprve přes horní vrstvu (médium pro kultivaci krve) a poté do hustého pufru (Histopaque). Zatímco částice s hustotou větší, než je hustota pufru (RBC a bakterie), sedimentují jak přes vývar krevních kultur, tak přes hustý pufr, méně husté separáty (WBC a trombocyty) jsou z pufru vyloučeny. Tento postup je podobný protokolu doporučenému pro separaci WBC a trombocytů z plné krve (16). Pro náš účel je však tento postup sám o sobě nedostatečný, protože zatímco některé nežádoucí částice (WBC a trombocyty) jsou od cílových částic (bakterií) odděleny na základě rozdílů v hustotě, jiné částice s podobnou hustotou (RBC) zůstávají. Abychom dosáhli našeho cíle shromáždit všechny cílové buňky (bakterie) a zároveň odstranit všechny zbývající nežádoucí částice (RBC), navrhujeme uvést systém do stavu znázorněného na obrázku 1(4) a tam proces odstřeďování zastavit. V tomto stavu jsou všechny RBC, které mají díky své větší velikosti vyšší rychlost usazování, uloženy na dně zkumavky jako peleta, zatímco všechny bakteriální buňky jsou rozptýleny v hustém pufru.

Pro dosažení tohoto požadovaného stavu však musí být splněna řada omezení. Za prvé, abychom zajistili, že všechny bakterie budou shromážděny v pufru, musíme poskytnout bakteriím, které začaly v horní části (rovina A), dostatek času na migraci přes vrstvu vývaru krevní kultury (médium 1) do Histopaku (médium 2). Matematicky to znamená, že:

kde t je doba, po kterou probíhá proces odstřeďování, l1 je délka vloženého sloupce vývaru krevních kultur a vb1 je sedimentační rychlost bakterií v této vrstvě. Tento časový okamžik (kdy bakterie, které začínají v rovině A, právě překročily rovinu B a dostaly se do pufru) je znázorněn na obrázku 1(2).

Dalším významným rysem tohoto stavu je, že bakterie a RBC nemusí do této doby vytvořit v pufru odlišné „pásy“. Zatímco RBC, které začínají v dané horizontální rovině, migrují dále než podobně umístěné bakterie, RBC, které začaly v rovině A, nemusely předstihnout bakterie, které začaly v rovině B (rozhraní mezi oběma kapalinami). Aby k tomu došlo a RBC a bakterie vytvořily v pufru odlišné pásy, musí být sloupec pufru dostatečně dlouhý. Vytvoření odlišných pásů není možné, pokud by například sloupec pufru sahal pouze do hloubky úrovně znázorněné přerušovanou čarou na obrázku 1(2). Matematicky lze podmínku, že RBC (rychleji se usazující částice) začínající na rovině A předstihnou bakterie (pomaleji se usazující částice) začínající na rovině B, vyjádřit takto:

kde l1 a l2 jsou délky sloupců vývaru krevní kultury (médium 1), resp. pufru (médium 2); vR1 a vR2 jsou sedimentační rychlosti RBC ve vývaru, resp. pufru; a vb2 je sedimentační rychlost bakterií v pufru. Výše uvedenou rovnici lze přeuspořádat tak, že získáme:

Kromě toho by bylo žádoucí, aby všechny bakterie původně přítomné v médiu 1 byly shromážděny v médiu 2. To znamená, že v době, kdy bakterie začínající v horní části (rovina A) překročí rozhraní mezi oběma fázemi (rovina B), nesmí bakterie začínající v rovině B dosáhnout dna. Matematicky se tato podmínka vyjadřuje takto:

kde vb1 je sedimentační rychlost bakterií v médiu 1. Výše uvedené lze přeformulovat tak, že získáme:

Jsou-li splněny rovnice (3) a (5), pak systém dosáhne stavu znázorněného na obrázku 1(4), kdy všechny RBC dosáhly dna zkumavky a vytvořily samostatnou vrstvu, ale žádná z bakterií tak neučinila. (Všechny jsou v médiu 2). Tento stav poprvé nastane, když všechny krvinky RBC (i ty, které začínají v rovině A) dosáhnou dna zkumavky. Matematicky lze tento časový okamžik (t1) znázornit takto:

Stav přestane existovat, když bakterie (ty, které se původně nacházely na rozhraní, tj. v rovině B) začnou dosahovat dna trubice. Doba, za kterou k tomu dojde (t2), je dána vztahem:

Pro dosažení co nejlepší separace je tedy třeba (i) zajistit, aby délky sloupců obou médií splňovaly rovnice (3) a (5); a (ii) aby doba, po kterou probíhá sedimentační proces (tcentrifugace), byla dána vztahem:

Pokračování v odstřeďování déle než t2 povede k situaci znázorněné na obrázku 1(5), kdy některé nebo všechny bakterie také sedimentují na dně. Pro získání čistých izolátů požadovaných druhů musí být proces odstřeďování zastaven ve fázi odpovídající obrázku 1(4), horní vrstva vyřazena a hustý pufr odebrán, aniž by byl narušen sediment na dně. V případě potřeby lze cílové částice odstředit a resuspendovat v jiném médiu.

Toto „pracovní okno“ mezi t1 a t2 je schematicky znázorněno na obrázku 2. Zde je na abscisách znázorněna doba centrifugace, zatímco na ordinátě je znázorněna frakce částic RBC a bakterií, které jsou přítomny v hustém pufru (médium 2). V obou případech frakce zpočátku stoupá, když migrují z horní vrstvy, zůstává po určitou dobu konstantní, když migrují jako pás v hustém pufru, a nakonec klesá, když se usadí na dně. Rychleji se pohybující RBC mají strmější sklon vzestupu a pádu a také kratší dobu, kdy jsou všechny přítomny v hustém pufru. Během „pracovního okna“ (zatažené pole) jsou v nárazníku přítomny prakticky všechny bakterie (∼100 %), ale prakticky žádné RBC (∼0 %).

Rychlosti sedimentace RBC a bakterií (které určují číselné hodnoty omezení daných rovnicemi 3,5 a 8) lze předpovědět na základě jejich tvaru, velikosti a hustoty. Sedimentační rychlost je dána (17) rovnicí:

kde ρ a ρl jsou hustoty částice a kapaliny, µ je viskozita kapaliny, R je efektivní poloměr částice a g je gravitační/centrifugační zrychlení. E. coli jsou tyčinkovité bakterie o délce 2 mikrony a průměru 0,5 mikronu (18). Proto je můžeme modelovat jako prolité sféroidy, jejichž efektivní sedimentační poloměr (R) je dán (19) vztahem:

kde a, a b jsou polodélky hlavní a vedlejší osy. Pro E. coli je tedy a = 1 mikron a b = 0,25 mikronu. Na základě těchto hodnot očekáváme, že E. coli bude mít sedimentační rychlost 26,7 mikronů za sekundu v horní kapalině a rychlost 6,56 mikronů za sekundu v Histopaque 1083.

Na druhé straně lidské RBC jsou bikonkávní disky o průměru 7-8 mikronů a tloušťce 2 mikrony (20). Lze je tedy modelovat jako oblé sféroidy, jejichž efektivní sedimentační poloměr je dán (19) vztahem:

kde a a a b jsou poloviny délek hlavní a vedlejší osy. Při hodnotách 4 mikrony pro a a 1 mikron pro b předpokládáme, že při centrifugaci naším přístrojem Eppendorf-5804 při relativní odstředivé síle 400×g budou RBC sedimentovat rychlostí 500 mikronů za sekundu přes horní vrstvu o hustotě ∼1.02 g/ml (podle našeho měření) a 101 mikronů za sekundu přes Histopaque (hustota = 1,083 g/ml).

Rychlost usazování částic lze přesněji předpovědět zohledněním interakcí mezi částicemi. Tyto interakce mezi částicemi vznikají, když kapalina vytlačovaná usazující se částicí směrem vzhůru naráží na jiné částice bezprostředně za nebo vedle první částice, které jsou vystaveny zvýšenému odporu kapaliny, a tím se snižuje efektivní (průměrná) sedimentační rychlost částic jako skupiny. Tento jev se nazývá „brzděné usazování“ a je třeba s ním počítat, pokud je objemová frakce částic nezanedbatelná. Pro výpočet efektivních rychlostí usazování v systémech s brzděným usazováním je k dispozici řada poloanalytických nebo empirických výrazů (21). Jedním z těchto přístupů je Richardson-Zakiho korelace, kde je efektivní rychlost usazování (v′) dána vztahem:

kde v je rychlost usazování částic v neomezeném případě a φ je objemová frakce částic. Krev se obvykle ředí do vývaru pro kultivaci krve v poměru 1:4 (22). Vzhledem k tomu, že hematokrit (objemová frakce RBC v krvi) je obvykle přibližně 0,4-0,45 (23), je výsledná objemová frakce RBC v našem vzorku přibližně 0,1. Pokud se toto zohlední pomocí rovnice 12, pak předpokládané rychlosti usazování RBC v prostředí 1 a 2 jsou 307 mikronů za sekundu, resp. 62 mikronů za sekundu. Také v době, kdy jsou krevní kultury pozitivní, obsahují ∼108 CFU (colony forming units) (buněk) bakterií na ml suspenze (24). Vzhledem k jejich malým rozměrům (poloměr ∼1 mikron) však jejich objemový podíl zůstává menší než 0,001 a efekt „ztíženého usazování“ lze zanedbat.

Při daném objemu vzorku, z něhož si přejeme izolovat zájmový(é) typ(y) buněk, lze použít vývojový diagram uvedený v doplňkových materiálech (doplňkový obrázek 1) k orientaci při výběru sedimentačního pufru, předpovědi sedimentačních rychlostí zájmových buněk v uvedeném pufru, určení vhodného objemu (délky kolony v dostupné centrifugační trubici), který se má použít, a nakonec k výpočtu optimální doby trvání centrifugace (pracovního okna) s použitím dostupné(ých) centrifugy(í). Pro náš systém (5 ml „pozitivního“ bujónu krevní kultury vloženého do 15ml centrifugačních zkumavek) je postup shrnut v tabulce 1.

Tabulka 1. Teoretické předpovědi minimální délky kolony a minimální/maximální provozní doby.

Experimentální ověření

Nejprve jsme připravili syntetický „pozitivní vývar z krevních kultur“ tak, že jsme do 8 ml média BACTEC Ped-Plus (Becton Dickinson, Sparks, MD) rozptýlili 2 ml čerstvé krve (odebrané dobrovolníkovi) a 0,5 ml krve.1ml suspenze obsahující ∼104 CFU (buněk) na ml E. coli K-12 a inkubací směsi na nutačním mixéru při 37 °C přes noc (12-14 h), aby se získala suspenze obsahující ∼109 RBCs/ml a 108 CFU/ml bakterií. Do mikrocentrifugační zkumavky (Eppendorf, New York, USA) bylo odebráno 1,5 ml bujónu a buňky byly „peletovány“ odstředěním. Supernatant byl odebrán a hmotnost 1 ml byla změřena pomocí vah (OHaus® GA-110), aby se odhadla hustota tekutiny v bujónu.

Dále bylo 5 ml pozitivního bujónu krevních kultur naloženo na 5 ml Histopaque-1083 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA). Více takových zkumavek bylo vloženo do stolní centrifugy Eppendorf-5804 a centrifugováno po různě dlouhou dobu (1 min, 3 min, 6 min, 10 min, 15 min, 30 min, 50 min, 70 min a 90 min). Na konci centrifugace byla zkumavka opatrně vyjmuta, vrchní vrstva (vývar z krevních kultur) byla vyhozena, zatímco vrstva Histopaque byla odebrána, aniž by byl narušen sediment na dně (pokud byl přítomen). Koncentrace bakterií v odebrané tekutině byla stanovena pomocí standardních metod zahrnujících sériové ředění, nanesení na Tryptic Soy Agar, inkubaci a počítání kolonií (25). Koncentrace RBC byla získána vyšetřením alikvotu vzorku v hemocytometru pod mikroskopem (26).

Výsledky a diskuse

Výsledky jsou shrnuty v obrázku 3. Čáry představují teoretický počet krevních buněk nebo bakterií, které by měly být přítomny ve vrstvě Histopaque (minus sediment na dně) na základě našich teoretických předpovědí. Plné symboly představují průměr nejméně tří odečtů pozorovaných počtů krvinek RBC (čtverce) a E. coli (kosočtverce). Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku.

Jak je vidět na obrázku 3, pozorované chování kvalitativně odpovídá našim předpovědím; pro obě husté částice (RBC a bakterie) koncentrace v Histopaque zpočátku s časem rostou, pak zůstávají po určitou dobu konstantní a nakonec klesají. Bylo však zjištěno, že v případě RBC probíhá celý proces (nárůst, ustálený stav a pokles) o něco pomaleji, než jsme předpokládali. Vliv této mírně nižší rychlosti sedimentace naštěstí nemá vliv na naše operační okno, protože začátek okna se řídí dobou potřebnou k tomu, aby se všechny bakterie dostaly do hustého pufru. V době, kdy k tomu dojde, je koncentrace RBC v hustém pufru zanedbatelná. Jinými slovy se ukazuje, že operační okno předpovězené našimi modely (∼20 min až ∼75 min) platí.

Většina běžně se vyskytujících bakterií je také poměrně malá (∼1 mikron charakteristické délky) a jejich hustota je podobná. (např. 1,1 g/ml pro Pseudomonas (27); 1,13 g/ml pro Streptococcus (28) a 1,135 g/ml pro Bacillus (29)). Je tedy pravděpodobné, že jejich sedimentační rychlost bude srovnatelná s rychlostí sedimentace E. coli v krevním kultivačním bujónu i v bujónu Histopaque-1083, a proto by i operační okno mělo být podobné. Ačkoli naše operační okno (∼20 min až ∼75 min) je použitelné pouze pro náš hardware a experimentální parametry, naše teoretická analýza poskytuje základ pro předpověď jiných operačních oken, a to nejen pro účely izolace bakterií z pozitivních krevních kultivačních bujónů při použití jiného hardwaru, ale také pro izolaci jiných cílových buněk z různých matric při použití hustých pufrů. Tuto metodu lze rovněž použít sekvenčním způsobem k izolaci cílové látky ze směsi obsahující rychleji i pomaleji sedimentující druhy. In such cases, one would use our method to first elimin all faster moving species, and subsequently, use it to collect the fastest settling species target in the remaining mixture.

.