Klonogenní test: co, proč a jak

Klonogenní test, známý také jako test tvorby kolonií

je in vitro test přežití buněk. Hodnotí schopnost jednotlivých buněk přežívat a rozmnožovat se a vytvářet kolonie.1 Tento test byl poprvé popsán v 50. letech 20. století, kdy byl použit ke studiu účinků záření na přežívání a růst nádorových buněk, a následně hrál zásadní roli v radiobiologii.2

Pro měření klonogenity je třeba buňky nasadit při velmi nízké hustotě a nechat je po dobu 1-3 týdnů, aby se vytvořily kolonie. Poté se kolonie fixují, obarví krystalovou violetí, aby byly viditelné, a spočítají. K analýze dat se vykreslí křivky přežití buněk. Klonogenní testy se dnes používají k zodpovězení řady experimentálních otázek, zejména v biologii nádorových onemocnění.

Tento blog zdůrazňuje:

Klonogenní testy se dnes používají k zodpovězení řady experimentálních otázek, zejména v biologii nádorových onemocnění:

Jak provést klonogenní test s důležitými úvahami, které je třeba na této cestě učinit

Použití mikroskopie bez značení a detekce konfluence k posouzení počtu a velikosti kolonií pomocí automatické kvantifikace obrazu

Klonogenní test přežití

Klonogenní testy jsou široce používány v oblasti výzkumu rakoviny, protože tvorba klonů je interpretována jako znak nádorových buněk se schopností iniciovat nádor. Ačkoli byl tento test původně používán v oblasti radiobiologie, stal se standardním nástrojem ve výzkumu rakoviny pro hodnocení buněčného růstu a cytotoxických nebo genotoxických účinků různých látek s potenciálním klinickým využitím. Patří sem chemoterapeutika a cílené terapie samostatně nebo v kombinaci. 3.

Klonogenní růst se také používá k hodnocení kmenovosti určitých buněčných populací, protože kmenové buňky jsou dlouho žijící buňky s potenciálem k pokračující proliferaci. To je zvláště důležité pro výzkum rakoviny, protože nádorové kmenové buňky jsou často spojeny s chemorezistencí, tvorbou sekundárních nádorů a recidivou rakoviny. Proto je zkoumání kmenových nádorových buněk pomocí klonogenního testu cenným a široce používaným nástrojem k předpovědi účinnosti konkrétní terapie.4

Klonogenní testy měří schopnost buněk zachovat si po delší dobu svou reprodukční integritu. To je důležitá vlastnost, protože odhaluje fenotypové účinky, které vyžadují čas a případně několik buněčných dělení, aby se vyvinuly. Při analýze terapeutické rezistence je to obzvláště důležité. Rezistenci k léčivům nelze identifikovat pomocí krátkodobých testů cytotoxicity.5

Jak provést klonogenní test

Informace v této části jsou převzaty od Frankena et al. (2006), kteří publikovali protokol klonogenního testu v Nature Protocols1, v kombinaci s některými poznatky z mých vlastních zkušeností získaných při provádění více než 60 klonogenních testů během mého doktorského studia.

V zásadě existují dva různé způsoby provedení klonogenního testu:

(1) Buňky lze nasadit při nízké hustotě a poté je ošetřit a zkoumat vliv ošetření na klonogenitu buněk.

(2) Buňky lze ošetřovat po určitou dobu a poté znovu nasadit při nízkých hustotách do média bez ošetření, aby se testovala klonogenní schopnost.

Tato metoda se často používá k posouzení rezistence na léčbu po léčbě. Obrázek 1 shrnuje první přístup, který je tradiční metodou provádění klonogenního testu. Jak bude zřejmé, jedná se o časově náročnou metodu, která neposkytuje žádné informace o průběhu experimentu (pouze koncový bod). Později se budeme zabývat automatizovanými a nekoncovými alternativními metodami.

Tradiční protokol pro klonogenní testy

Obrázek. 1 | Shrnutí tradičního klonogenního protokolu, při kterém se buňky vysévají, ošetřují a poté se hodnotí klonogenita.

Klonogenní testy se obvykle provádějí na destičkách se 6 nebo 24 jamkami. Buňky je třeba rozmístit řídce a rovnoměrně, aby se mohly vytvořit izolované kolonie. Proto je důležité před provedením klonogenního testu optimalizovat hustotu výsevu pro zvolenou velikost jamek.

Dobrým výchozím bodem je podívat se do literatury, zda byly provedeny nějaké studie klonogenních testů s vaší buněčnou linií, a poté otestovat tuto hustotu výsevu a dvě nebo tři další. Během tohoto optimalizačního procesu je také důležité zvážit váš koncový bod experimentu (např. 7 dní, 14 dní nebo 21 dní) a rychlost růstu buněk, protože nechcete, aby docházelo ke slučování kolonií, což by narušilo kvantifikaci a analýzu kolonií. Hustota výsevu by měla být stejná pro všechny podmínky ošetření v rámci vašeho experimentu.
Použití správných kontrol je pro fázi analýzy zásadní. Vždy je třeba použít neošetřenou kontrolu a také kontrolu pouze s vehikulem (může to být DMSO, PBS nebo jakékoli rozpouštědlo, ve kterém je vaše ošetření rozpuštěno). Pro podmínky ošetření se často používá řada ředění. Doba ošetření a přísnost vašeho ošetření pomůže určit váš koncentrační rozsah – to bude pravděpodobně vyžadovat určitou optimalizaci. Každá kontrolní a experimentální podmínka by měla být provedena ve třech opakováních.

V průběhu fáze tvorby kolonií budete muset sledovat růst kolonií za všech podmínek ošetření. Za kolonii se považuje 50 a více buněk, které jsou viditelné pouze pod mikroskopem. Vzhledem k tomu, že tato zkouška obvykle probíhá po dlouhou dobu, budete muset měnit buněčná média. Na začátku budou buňky ve velmi nízké konfluenci, takže nebudete muset měnit média tak pravidelně jako obvykle. Pokud však vyséváte a následně ošetřujete léčivem nebo sloučeninou, je důležité vzít v úvahu její poločas rozpadu a podle potřeby přidávat čerstvé ošetření.

Pro výzkumníky, kteří se zajímají o zobrazování růstu kolonií v průběhu času. Doporučujeme podívat se na přístroj CytoSMART Omni.

—————–

Často jsou to kolonie v kontrolních podmínkách, které rostou nejrychleji, a proto můžete tyto buňky použít jako ukazatel konečného bodu vašeho experimentu, tj. ukončete experiment dříve, než se vaše kolonie začnou slučovat, a pokud k tomu dojde příliš rychle, použijte raději nižší hustotu výsevu pro váš experiment. Je důležité ukončit pokus pro všechny podmínky ošetření ve stejnou dobu.

Po dosažení konečného bodu pokusu je třeba buňky jemně propláchnout PBS (PBS přidejte na stranu jamky, aby nedošlo k narušení kolonií), fixovat a obarvit interkalačním barvivem DNA, krystalovou violetí (0,5 % w/v) po dobu nejméně 30 minut. Odstranění přebytečného barviva může být nepříjemné. Nejlepší technikou je jemně ponořit destičky do kádinky ponořené do vody, dokud se neodstraní veškeré přebytečné barvivo a nezůstanou jen jasně fialové kolonie. Obarvené kolonie lze počítat až 50 týdnů po obarvení. Pořizujte snímky jamek ve vysokém rozlišení, které můžete použít pro analýzu, prezentace a publikační obrázky.

Pro podporu výzkumných pracovníků při analýze a optimalizaci jejich testů tvorby kolonií představila společnost CytoSMART aplikaci pro přístroj CytoSMART Omni, která umožňuje detekovat kolonie na (časosběrných) snímcích celých jamkových destiček při 10násobném zvětšení. Časosběrné snímání v inkubátoru může poskytnout spíše kinetické informace než informace o koncovém bodu, což může poskytnout podrobnější informace o tom, kdy léčba začíná působit na buňky. Analýza obrazu bez označení se používá k detekci kolonií, hodnocení jejich velikosti a kruhovitosti. Přesně určit, kdy se kolonie začínají slučovat, a podle toho optimalizovat.

Jak analyzovat váš klonogenní test

Je to opravdu tak jednoduché, jako ručně spočítat kolonie pro každou podmínku ošetření a znázornit data jako křivku přežití (pro křivku byste měli použít alespoň tři biologická opakování).

Křivka přežití vyžaduje výpočet přežívající frakce (SF) ošetřených buněk (zahrnuje poměr vytvořených kolonií k nasazeným buňkám) a její vynesení do grafu v závislosti na dávce ošetření. Před výpočtem SF je třeba určit účinnost pokovení (PE) vašich buněk, protože různé buněčné linie mají různou účinnost pokovení, což ovlivňuje výpočet frakce přežití.

PE je poměr počtu kolonií k počtu nasazených buněk ve vašich neošetřených buňkách1. Obrázek 1 ukazuje vzorce PE a SF a příklad křivky přežití.

Ruční počítání kolonií je únavné a může být náchylné ke zkreslení, proto byla vyvinuta řada volně dostupných počítačových nástrojů pro analýzu obrazu, které umožňují rychle a objektivně analyzovat obrazy klonogenních testů. Za zmínku stojí volně dostupný softwarový balíček vyvinutý Brzozowskou et al. (2019), který nejen počítá kolonie, ale také vykresluje distribuci jejich velikosti, což je další vrstva užitečných informací o buněčném chování (viz obrázek 2a).6

Alternativou k počítání a kvantifikaci jednotlivých kolonií je stanovení procenta plochy jamky, která je pokryta koloniemi (procento plochy kolonií), pro kvantifikaci růstu klonogenních buněk. Guzmán et al. (2014) vyvinuli volně dostupný zásuvný modul pro ImageJ s názvem ColonyArea, který právě toto provádí (viz obrázek 2b).7Je to užitečný nástroj, který lze použít, pokud máte sloučené kolonie, které se obtížně počítají okem nebo softwarem pro počítání kolonií, nebo pokud chcete rychlou a vysoce výkonnou metodu analýzy.

Obrázek. 2 | Volně dostupné nástroje pro měření klonogenních testů. (A) Brzozowska a kol. vyvinuli software (countPHICS), který počítá kolonie a měří jejich velikost.6 (B) Guzmán a kol. vyvinuli plugin ImageJ, ColonyArea, který kvantifikuje plochu růstu kolonií a intenzitu barvení.7

Bezznačkový, nekoncový, poloautomatický protokol klonogenního testu

Nedávný článek Mayra a kol. (2018), popisuje nový a upravený protokol klonogenního testu, který k měření kolonií používá 96jamkový formát mikrodestiček a detekci konfluence. Tato metoda umožňuje komplexní experimentální nastavení pomocí 96jamkové destičky, je bez značení, nemá žádný koncový bod barvení a analýza je poloautomatická (obrázek 3)8. Kromě toho časově rozlišené měření konfluence bez koncového bodu ve stejné jamce ukázalo, že poloautomatická analýza je vhodná pro stanovení počtu kolonií a jejich průměrné velikosti.

Figure. 3 | Mayr a kol. hodnotili klonogenní růst ve formátu 96 jamek v průběhu času pomocí detekce konfluence8. Graf ukazuje kvantifikaci klonogenního růstu v různých časových bodech a obrázky zobrazují konkrétní jamky s detekcí konfluence. Zelené skvrny představují oblasti detekované čtečkou konfluence a oranžové šipky označují sloučené kolonie.

Tato metoda klonogenního testu poskytuje časově a nákladově efektivní alternativu ke standardnímu protokolu klonogenního testu. Díky tomu, že není nutná fixace a barvení v koncovém bodě, umožňuje tento protokol průběžné sledování a analýzu klonogenního růstu. Kromě toho lze během experimentu získat další metriky o kinetice růstu kolonií. Miniaturní formát také otevírá možnost testovat nákladné léčebné postupy, jako jsou terapie založené na siRNA nebo CRISPR/Cas9, které by nebyly proveditelné při objemu potřebném pro 6jamkovou nebo 24jamkovou destičku. Mayr a spol. nakonec prokázali, že mikroskopie bez značení s detekcí konfluence je robustní a životaschopnou možností měření klonogenity.

Bezznačkovým, nekonečným a automatizovaným řešením pro vaše testy klonogenity je CytoSMART Omnis algoritmem detekce kolonií. Tvorba kolonií se měří v průběhu času v celé jamce s odečtem počtu kolonií, velikosti a cirkularity. Vaše buňky nemusí opustit inkubátor a lze získat informace o buněčné kinetice během procesu tvorby kolonií (obr. 4).

Obr. 4 | Automatizovaná detekce kolonií pomocí přístroje CytoSMART Omni. Buňky jaterního karcinomu HEP-G2 ve 24jamkové destičce byly zobrazovány po dobu 75 hodin pomocí přístroje CytoSMART Omni, který je umístěn ve standardním inkubátoru s CO2. Obrázek ukazuje plnou jamku po spuštění algoritmu detekce kolonií se shluky buněk zvýrazněnými oranžovou maskou kolonií. Počet kolonií, jejich velikost a kruhovitost byly měřeny po celou dobu trvání testu a zobrazeny v grafech.

O všech zobrazovacích řešeních CytoSMART se dozvíte zde

.