Kyselá přeměna nordiazepamu může ovlivnit odhad výtěžnosti při stopové analýze diazepamu a nordiazepamu v environmentálních vzorcích vody pomocí kapalinové chromatografie-tandemové hmotnostní spektrometrie

Systémy kapalinové chromatografie-tandemové kvadrupólové hmotnostní spektrometrie

Vyvinuté izokratické i gradientové eluční systémy poskytly dobré rozlišení píků (Rs ≥ 3,1) pro diazepam a nordiazepam. V izokratickém systému byly retenční časy 2,6 min (0,54 RSD %) a 4,1 min (0,27 RSD %) pro standardy nordiazepamu-d5 a diazepamu-d5. V matrici povrchové vody byly retenční časy stejné jako u standardů a hodnoty RSD byly 0,62 % pro nordiazepam-d5 a 0,30 % pro diazepam-d5. Retenční časy pro pracovní standardy v gradientovém systému byly 2,4 min (0,90 % RSD) a 2,9 min (0,70 % RSD) pro nordiazepam a diazepam. Přesnost retenčních časů pro sloučeniny v upravené odpadní vodě je uvedena v tabulce 1, kde hodnoty RSD byly ≤ 0,35 %.

Diazepam a nordiazepam byly identifikovány ve vzorcích upravené odpadní vody podle jejich charakteristických MS/MS přechodů a retenčních časů (tabulka 1). Pro každou sloučeninu byl sledován jeden prekurzorový ion a dva fragmentové ionty. Pro identifikaci „přirozeně“ se vyskytujícího diazepamu a nordiazepamu byly porovnány poměry ploch píků získaných ze dvou fragmentových iontů s plochami standardů (tabulka 1). Rovněž byly porovnány retenční časy cílových sloučenin s retenčními časy diazepamu-d5 a nordiazepamu-d5 ve stejném chromatografickém cyklu.

Vývoj metody extrakce na pevné fázi

Stabilita diazepamu a nordiazepamu v kyselých a neutrálních vodných vzorcích

Odebrané vzorky vody z životního prostředí se před analýzou vznikajících kontaminantů běžně uchovávají při kyselém pH . V této studii byla studována stabilita diazepamu a nordiazepamu při skladování jako pracovních standardů (při pH 3,1 a pH 7,0). Bylo zjištěno, že nordiazepam byl při skladování v kyselém roztoku při pokojové teplotě značně degradován. Během 12 dnů bylo degradováno 56 % nordiazepamu (obr. 2). Degradace nebyla tak rozsáhlá, když byl pracovní roztok skladován při 4 °C; po 12 dnech bylo degradováno 20 % počáteční koncentrace nordiazepamu. Na druhé straně bylo zjištěno, že diazepam je stabilní při pH 3,1 při skladování při pokojové teplotě a při 4 °C (obr. 2). Během 12 dnů bylo při pokojové teplotě degradováno pouze 0,53 % a při 4 °C 3,1 % diazepamu. Ukázalo se, že obě sloučeniny jsou stabilní po dobu 12 dnů při neutrálním pH. Ve 12. dni byly reakce diazepamu a nordiazepamu (při skladování při 4 °C a při pokojové teplotě) 101-103 % počátečních reakcí. Hodnoty RSD (n = 3) pro stanovené koncentrace v různých časových bodech byly ≤ 5,1 %. Reakce byla původně objevena ve vzorcích odpadních vod, ale experimenty byly prováděny v připravených roztocích, aby se zjednodušily podmínky a snížila možnost dalších reakcí/efektů ve velmi složitých matricích odpadních vod.

Stabilita diazepamu a nordiazepamu v 5 mM kyselině mravenčí v čištěné vodě, pH 3. Diazepam skladovaný při 4 °C (bílý trojúhelník) a při pokojové teplotě (černý trojúhelník). Nordiazepam skladovaný při 4 °C (bílý čtverec) a při pokojové teplotě (černý čtverec). Podrobnosti o experimentu jsou popsány v „Stability studies of diazepam and nordiazepam in acidic and neutral aqueous solutions“

Naše výsledky ukazují, že nordiazepam je nestabilní při pH 3, tyto výsledky jsou v souladu s výsledky v literatuře, které ukazují, že nordiazepam podléhá hydrolýze v kyselých roztocích. Archontaki a spol. zjistili, že nordiazepam je hydrolyzován v kyselých vodných roztocích a že první krok rozkladu je reverzibilní. Výsledky této studie se však mohou zdát v rozporu s výsledky nedávné studie, kde bylo zjištěno, že nordiazepam (a diazepam) jsou stabilnější při pH 2 než při pH 7 . Tento rozdíl je ve skutečnosti očekávaný, pokud vezmeme v úvahu různé strategie stanovení výtěžnosti. Vzhledem k tomu, že přeměna nordiazepamu je během odpařování a zahřívání obrácená, nemusí to mít žádný praktický dopad na rutinní používání metody. Teprve při odhadu výtěžnosti podle doporučení Matuszewského a kol. v kombinaci s nestabilitou nordiazepamu při nízkém pH získáme ztrátu sloučeniny, a tedy zdánlivě vysokou výtěžnost.

Výtěžnost extrakce tuhou fází pro simulované vzorky vody z životního prostředí, uchovávané při nízkém pH vzorku

Výtěžnost extrakce tuhou fází a matricový efekt byly stanoveny v upravených vzorcích vody pomocí LC-MS s použitím přístupu navrženého Matuszewským a kol , podrobnosti jsou uvedeny ve „Validaci metody“. Extrakční výtěžnost byla stanovena pro standardy značené izotopy, diazepam-d5 a nordiazepam-d5, protože se neočekává, že by se značené sloučeniny vyskytovaly v environmentálních matricích . V této studii byly pracovní standardy diazepamu-d5 a nordiazepamu-d5 skladovány v 5 mM kyselině mravenčí v čištěné vodě pH 3,1/acetonitrilu (90/10, v/v), nejdéle po dobu 1 týdne při 8 °C, a byly použity k přípravě sad A-C.

Relativní extrakční výtěžky, stanovené při jedné nízké a jedné vysoké koncentraci, jsou uvedeny v tabulce 2 (extrakční metoda je uvedena v části „Příprava vzorku a extrakce na pevné fázi“). Extrakční výtěžnost byla vyšší pro nordiazepam-d5 než pro diazepam-d5. Pro nordiazepam-d5 byly relativní extrakční výtěžky 114 ± 8,1 % a 117 ± 21 % při nízké a vysoké koncentraci. Hodnoty RSD získané pro diazepam-d5 byly 6,0 % pro nízkou a 24 % pro vysokou koncentraci (tabulka 2). Vysokých hodnot RSD (≥ 18 %) pro postup extrakce na pevné fázi se někdy dosahuje při stanoveních na úrovni stop ve složitých matricích . Kromě toho byly již dříve v literatuře zaznamenány vysoké výtěžnosti extrakce (≥ 100 %) pro nordiazepam ve vzorcích vody z životního prostředí . Jak bude uvedeno níže, vysoké výtěžnosti by mohly souviset s chemickou rovnováhou mezi nordiazepamem a produktem přeměny.

Absolutní extrakční výtěžnost pro nordiazepam-d5 byla stanovena na 139 ± 21 % a matricový efekt na 119 ± 3,0 %. Vysokou absolutní extrakční výtěžnost pro nordiazepam-d5 lze částečně vysvětlit tím, že nordiazepam-d5 podléhal zesílení iontů v MS rozhraní. Ukázali jsme však, že vysoká extrakční výtěžnost (> 100 % pro relativní extrakci, jak je uvedeno výše) nebyla způsobena pouze matricovými efekty ve zdroji ESI. To bylo zjištěno na základě relativních extrakčních výtěžností získaných podle Matuszewského a kol. v případě, že extrahované a neextrahované vzorky byly vstřikovány do systému LC-MS/MS rozpuštěné ve stejné matrici. Kromě toho, aby se dále ověřilo, že vysoké extrakční výtěžnosti nesouvisely s žádným procesem v rozhraní hmotnostního spektrometru, byly extrakční výtěžnosti pro diazepam-d5 a nordiazepam-d5 stanoveny pomocí druhé detekční techniky, LC-UV. Výtěžnost jednoho extrahovaného vzorku nordiazepamu-d5 ve fosfátovém pufru (pH 7,0) analyzovaného pomocí LC-MS/MS i LC-UV byla stanovena na 159 % a 153 % (n = 2). Dospěli jsme k závěru, že vysoké extrakční výtěžnosti pro nordiazepam nebyly do značné míry způsobeny žádným procesem v hmotnostním spektrometru.

Závěrem lze říci, že i když byly získané extrakční výtěžnosti a hodnoty RSD vysoké, pravděpodobně se budou jevit jako přiměřené, protože koncentrace cílových sloučenin byly nízké (50 a 250 pM) a protože sloučeniny byly extrahovány z komplexní matrice. V této studii jsme chtěli prokázat, že tyto vysoké výtěžnosti získané pro nordiazepam by mohly souviset s chemickou rovnováhou mezi nordiazepamem a transformačním produktem, kterou zjistili Archontaki a kol .

Regenerace nordiazepamu během přípravy vzorku

Při skladování roztoků diazepamu a nordiazepamu (pH 3.1, při pokojové teplotě, „Stabilita diazepamu a nordiazepamu v kyselých a neutrálních vodných vzorcích“) byly použity ke špikování fosfátového pufru a poté podrobeny extrakci na pevné fázi, byly odezvy získané z rekonstituovaných extraktů nordiazepamu větší ve srovnání s odezvami získanými z neextrahovaných skladovaných roztoků. Extrakcí v pevné fázi se plocha píku nordiazepamu zvýšila z 26 počtů ploch (2,7 % RSD, n = 3) na 45 počtů ploch (14,6 % RSD, n = 3).

Pro ověření, že nordiazepam byl během extrakce na pevné fázi regenerován, byl do systému LC-MS/MS vstříknut jeden uložený vzorek nordiazepamu-d5 (poskytující plochu píku 1470 pro fragmentový ion m/z 213) a jeden zpracovaný vzorek nordiazepamu-d5 (s plochou píku 1790). Kromě SRM kanálu nordiazepamu-d5 (276 → 213) byly získány další dva SRM kanály, tab. 1. Byly nastříknuty uložené vzorky nordiazepamu-d5 (n = 6) a poměry přechodů SRM byly stanoveny na 1,4 (3,8 % RSD, poměr fragmentových iontů m/z (276 → 213)/(276 → 165) a 1,0 (3,5 % RSD, poměr fragmentových iontů m/z (276 → 213)/(276 → 140). U zpracovaného vzorku nordiazepamu-d5 byly poměry SRM přechodů stejné, tj. 1,4 a 1,0. V případě nordiazepamu-d5 byly poměry SRM přechodů stejné. Mezi uloženými a zpracovanými vzorky tedy nebyly žádné významné rozdíly v poměrech fragmentových iontů. Kromě toho byly retenční časy u obou vzorků stejné. Byl učiněn závěr, že se jedná o nordiazepam-d5, který byl detekován jak ve skladovaných, tak ve zpracovaných vzorcích.

Archontaki a kol. zjistili, že nordiazepam se v kyselém vodném roztoku přeměňuje na meziprodukt N-(2-benzoyl-4-chlorfenyl)-2-aminoacetamid s molekulovým vzorcem C15H13N2O2Cl a monoizotopickou hmotností 288,1 Da. Produkt přeměny byl krystalizován a analyzován pomocí LC-UV, GC-MS, 1H- a 13C-NMR a IR spektroskopie. Chemická rovnováha meziproduktu a nordiazepamu byla reverzibilní, avšak další transformace meziproduktu na konečný produkt rozkladu (C13H10NOCl) reverzibilní nebyla. V této studii byl v uchovávaném roztoku (pH 3,1) nordiazepamu pomocí LC-MS detekován ion s retenčním časem 3,0 min a poměrem hmotnosti k náboji 289,0. Tento ion by mohl odpovídat + produktu přeměny nordiazepamu. Kromě toho isotopický vzorec iontu v čase 3,0 min odpovídal isotopickému vzorci pro jeden atom chloru. Chromatografický pík navíc eluoval před nordiazepamem, což je v souladu s výsledky separací nordiazepamu a N-(2-benzoyl-4-chlorfenyl)-2-aminoacetamidu v systému s obrácenými fázemi, který použili Archontaki et al. Detekovaný pík ve skladovaném kyselém vodném roztoku byl tedy v této studii pravděpodobně N-(2-benzoyl-4-chlorfenyl)-2-aminoacetamid. Navíc poměr plochy píku nordiazepamu a N-(2-benzoyl-4-chlorfenyl)-2-aminoacetamidu byl v tomto skladovaném vodném roztoku v předložené studii 0,75 (n = 2). V odpařených směsích methanolu (podrobnosti experimentu jsou popsány v části „Studie stability diazepamu a nordiazepamu v kyselých a neutrálních vodných roztocích“) se však poměr plochy píku nordiazepamu a N-(2-benzoyl-4-chlorfenyl)-2-aminoacetamidu zvýšil na 1,9 (6,8 RSD %, n = 4), tj, plocha píku nordiazepamu se zvýšila a plocha píku N-(2-benzoyl-4-chlorfenyl)-2-aminoacetamidu se snížila ve srovnání se vzorkem, který nebyl odpařen. Ve slepém vzorku nebyly zjištěny žádné píky N-(2-benzoyl-4-chlorfenyl)-2-aminoacetamidu ani nordiazepamu. Tyto výsledky silně naznačují, že chemická rovnováha nordiazepamu a transformačního produktu nordiazepamu, charakterizovaného Archontaki et al., se během odpařování SPE extraktů posunula z N-(2-benzoyl-4-chlorfenyl)-2-aminoacetamidu na nordiazepam. Nebyl zjištěn žádný pík, který by mohl souviset s konečným produktem rozkladu (C13H10NOCl) nordiazepamu.

Dospělo se k závěru, že nordiazepam se v kyselém vodném roztoku snadno přeměňuje na N-(2-benzoyl-4-chlorfenyl)-2-aminoacetamid. Zajímavé je, že nordiazepam byl regenerován během procesu extrakce na pevné fázi. Použitím skladovaných roztoků nordiazepamu při pH 3,0 jako referenčního roztoku při výpočtech extrakčních výtěžků jsou tedy extrakční výtěžky nadhodnoceny. Tyto výsledky jsou důležité při validaci metody, tj. při posuzování podmínek skladování, extrakčních výtěžků a vlivu matrice. Transformace nordiazepamu může navíc ovlivnit celkové analytické výsledky, pokud se jako vnitřní standard nepoužije izotopově značený analog nordiazepamu. Je také třeba zdůraznit, že transformace nordiazepamu může ovlivnit přesnost metody, a to nejen během skladování před extrakcí na pevné fázi, ale také v závislosti na pH použitého roztoku, např. při rekonstituci sušených SPE extraktů.

Validace metody

Vyvinutá metoda byla validována použitím izotopem značených analogů, diazepamu-d5 a nordiazepamu-d5 („validace metody“), protože tyto sloučeniny nebyly ve vzorcích životního prostředí detekovány. Výhodou použití značených analogů pro validaci metody je, že metoda může být validována na stopových úrovních ve skutečné matrici, ve které jsou analyty kvantifikovány . Relativní výtěžnost extrakce ve vzorcích upravených odpadních vod byla ≥ 87 % pro diazepam-d5 a nordiazepam-d5 při vysoké a nízké koncentraci (tabulka 3). Získané hodnoty jsou v rozmezí, které lze očekávat při extrakci stopových koncentrací léčivých látek ze složitých matric . Absolutní výtěžnost extrakce byla nižší, 63-86 %, protože analyty byly podrobeny potlačení iontů (tabulka 3). Při nízkých koncentracích byly matricové efekty (ME %) 76 ± 14 % pro diazepam-d5 a 88 ± 14 % pro nordiazepam-d5 (tabulka 3). Při vysoké koncentraci byl účinek matrice a hodnoty RSD ve stejném rozmezí jako při nízké koncentraci. Tyto hodnoty ME % jsou v přijatelném rozmezí, protože výsledky jiných studií ukazují, že matricový efekt získaný s matricemi environmentální vody může být poměrně vysoký. Přesnost metody byla určena stanovením výtěžnosti SPE při nízké a vysoké koncentraci diazepamu-d5 a nordiazepamu-d5 (tabulka 3). Relativní výtěžnost byla 88 ± 7,6 % a 87 ± 12 % pro diazepam-d5 při nízké a vysoké koncentraci, resp. 98 ± 7,8 % a 99 ± 6,1 % pro nordiazepam-d5.

Přesnost chromatografického systému, vyjádřená jako hodnoty RSD retenčních časů získaných pro diazepam-d5 a nordiazepam-d5 v extrahovaných vzorcích odpadních vod, byla ≤ 0,62 %. Hodnoty RSD ploch píků pro diazepam-d5 a nordiazepam-d5 v extrahovaných vzorcích odpadních vod byly ≤ 7,8 % („The liquid chromatography tandem quadrupole mass spectrometry systems“). Kromě toho byla linearita, vyjádřená jako korelační koeficient (R2) kalibračních křivek v upravených vzorcích odpadních vod, 0,988 pro diazepam a 0,957 pro nordiazepam.

V této studii nebyl pozorován žádný přenos v systému LC-MS/MS, protože v žádném z injektovaných přečištěných vzorků vody Millipore nebyly zjištěny žádné píky analytů nebo izotopově značených sloučenin. Nic nenasvědčovalo tomu, že by při manipulaci se vzorky nebo při extrakci na pevné fázi došlo ke křížové kontaminaci, protože extrahované vzorky fosfátového pufru neobsahovaly žádné cílové sloučeniny. Riziko získání falešně pozitivních nálezů v důsledku vlastní kontaminace bylo proto v této studii považováno za minimalizované.

LOQ a LOD pro diazepam-d5 a nordiazepam-d5 byly stanoveny ve vzorcích upravené odpadní vody. Meze stanovitelnosti byly stanoveny na 5,0 pM (1,4 ng L-1) pro diazepam-d5 i nordiazepam-d5, přičemž poměr signál/šum byl přibližně 10 a získaná přesnost byla 12,7 a 15,9 % RSD (n = 3) pro příslušné sloučeniny (tabulka 3), tj. v rámci stanovené přesnosti 20 % . Hodnoty LOQ získané v této studii jsou v rozmezí hodnot, kterých bylo dosaženo v jiných studiích pro diazepam a nordiazepam ve vzorcích vyčištěných odpadních vod . V této studii však byl extrahován objem 200 ml vyčištěné odpadní vody ve srovnání se 75 ml v naší předložené metodě. Meze detekce byly pro diazepam-d5 1,7 pM (0,49 ng L-1) a pro nordiazepam-d5 2,0 pM (0,55 ng L-1) (tab. 3).

Jak bylo uvedeno výše („Stabilita diazepamu a nordiazepamu v kyselých a neutrálních vodných vzorcích“, obr. 2), bylo prokázáno, že diazepam a nordiazepam jsou stabilní po dobu 12 dnů při pH vzorku 7. V případě diazepamu a nordiazepamu se jednalo o stabilitu po dobu 12 dnů.0 při skladování při pokojové teplotě nebo při 4 °C.

Kvantifikace diazepamu a nordiazepamu v environmentálních vzorcích vody

Vyvinutá metoda LC-MS/MS byla použita na environmentální vzorky vody pro stanovení diazepamu a nordiazepamu. Je třeba zdůraznit, že vyvinutou metodu lze použít pro stanovení diazepamu a nordiazepamu ve vzorcích životního prostředí v kyselých podmínkách, pokud se ke vzorkům před skladováním přidají ideální vnitřní standardy, tj. izotopově značené sloučeniny cílových sloučenin. V této studii byly jako vnitřní standardy použity izotopem značené sloučeniny, diazepam-d5 a nordiazepam-d5, které kompenzují možnou transformaci sloučenin a další ztráty i odchylky během analýzy.

Ve vzorcích vyčištěných odpadních a povrchových vod byly analyzovány diazepam a nordiazepam. Mezi poměry iontů získanými pro standardní roztoky (tabulka 1) a poměry získanými pro „přirozeně“ se vyskytující diazepam nebo nordiazepam nebyly na 5% hladině v t testu zjištěny žádné významné rozdíly (P ≥ 0,07). Koncentrace diazepamu a nordiazepamu byly stanoveny na 8,5 (2,4 ng L-1), resp. 66 pM (18 ng L-1). Ve vzorcích ze stejné čistírny odpadních vod odebraných o 14 dní později byly stanoveny koncentrace diazepamu 7,5 (2,1 ng L-1) a nordiazepamu 75 pM (20 ng L-1). Koncentrace nordiazepamu byly tedy stanoveny přibližně o jeden řád vyšší než koncentrace diazepamu. Tyto výsledky jsou v souladu s výsledky jiných studií odpadních vod . Kromě toho byl v některých vzorcích vyčištěných odpadních vod, uváděných v literatuře, kvantifikován nordiazepam, ale diazepam nebyl zjištěn . V této studii nebyl diazepam ani nordiazepam zjištěn v povrchové vodě odebrané z řeky Fyris, 3 km proti proudu od čistírny odpadních vod Kungsängsverket, což svědčí o malém množství antropogenních emisí z odpadních vod proti proudu.

.