- Abstract
- Úvod
- Pacienti a metody
- Pacienti
- Bakteriální kmeny a mikrobiologické metody
- Antimikrobiální látky
- Amplifikace a sekvenování DNA oblastí určujících rezistenci k chinolonům
- Genetická detekce genů pro metalo-β-laktamázy
- Příprava proteinů vnější membrány
- Výsledky
- Citlivost
- Rezistence k fluorochinolonům
- Rezistence ke karbapenemům
- Diskuse
- Poznámky autorů
Abstract
Cíle: Pseudomonas putida je neobvyklý oportunní patogen, obvykle citlivý na antimikrobiální látky. Údaje týkající se rezistence k antimikrobiálním látkám u klinických izolátů P. putida jsou omezené.
Pacienti a metody: Citlivost k fluorochinolonům, karbapenemům a dalším antibiotikům byla charakterizována u pěti klinických izolátů P. putida získaných od různých pacientů s infekcemi močových cest jako původců. Rezistence k fluorochinolonům a karbapenemům byla charakterizována geneticky metodami PCR a sekvenování DNA. Profily vnějších membránových proteinů (OMP) byly charakterizovány pomocí SDS-PAGE.
Výsledky: Čtyři z pěti izolátů byly rezistentní nebo intermediární k fluorochinolonům i karbapenemům. Sekvence nukleotidů v oblastech určujících rezistenci k chinolonům naznačují, že k vysoké rezistenci k fluorochinolonům mohou přispívat aminokyselinové mutace jako Thr-83→Ile v GyrA a Glu-469→Asp v GyrB. Čtyři izoláty produkující metalo-β-laktamázu, které vykazovaly rezistenci ke karbapenemům, nesly geny pro metalo-β-laktamázu typu IMP. Kombinovaný účinek snížené produkce 46 kDa OMP a produkce metalo-β-laktamázy prokázal izolát P. putida vykazující nejvyšší MIC karbapenemů.
Závěry: Tato studie identifikovala mechanismy rezistence vůči fluorochinolonům a karbapenemům u klinických izolátů P. putida.
Úvod
Pseudomonas putida, nefermentující gramnegativní bacil, je oportunní lidský patogen zodpovědný za bakteriémii a sepsi u novorozenců, neutropenických a onkologických pacientů a také za infekce močových cest (UTI).1-4 Ačkoli je P. putida vzácná, může být příčinou nozokomiálních infekcí u kompromitovaných hostitelů.3
Většina P. putida je citlivá na antimikrobiální látky, jako jsou karbapenemy, fluorochinolony a aminoglykosidy.5-7 Byly však hlášeny klinické izoláty P. putida, které produkují metalo-β-laktamázy propůjčující rezistenci k β-laktamům včetně karbapenemů.3,4,8,9 Dále byly nedávno hlášeny izoláty produkující metalo-β-laktamázy, které kromě β-laktamů vykazovaly rezistenci k ciprofloxacinu, gentamicinu a tobramycinu.3 Výskyt P. putida rezistentních k více léčivům se stal příčinou obtíží při léčbě infekcí a představuje riziko nozokomiálního přenosu.
V několika předchozích studiích byla rezistence k antibiotikům u P. putida charakterizována s ohledem na produkci metalo-β-laktamáz a vlastnosti efluxních systémů.3,4,8-12 Podle zpráv z Evropy, Koreje a Japonska P. putida rezistentní ke karbapenemům často produkuje metallo-β-laktamázy typu IMP a VIM.3,4,8,9,9a Efluxní systémy, jako jsou TtgABC, MepABC, TtgDEF a ArpABC, mohou rovněž přispívat k rezistenci P. putida k více léčivům.10-12Pseudomonas aeruginosa má schopnost rychle se stát rezistentní v průběhu léčby,13 i když není jasné, zda má P. putida stejný potenciál. K posouzení rizik, že se objeví rezistence k antibiotikům, jsou zapotřebí hojné údaje týkající se rezistence k antimikrobiálním látkám u klinických izolátů P. putida. V této studii jsme stanovili citlivost k antimikrobiálním látkám včetně fluorochinolonů a karbapenemů a charakterizovali mechanismy rezistence k fluorochinolonům a karbapenemům u klinických izolátů P. putida získaných jako patogeny způsobující UTI během jednoho roku v naší nemocnici.
Pacienti a metody
Pacienti
Pět pacientů (čtyři muži a jedna žena) s diagnózou akutní, opakované nebo chronické UTI způsobené P. putida. putida v Hamamatsu University Hospital byli zařazeni do naší studie od října 2001 do září 2002.
Bakteriální kmeny a mikrobiologické metody
Kmeny použité v této studii bylo pět klinických izolátů P. putida získaných od různých pacientů jako původci onemocnění. Identifikace byla provedena standardními biochemickými testy v naší laboratoři klinické mikrobiologie. Všechny izoláty byly získány z moči. Vzory fragmentů chromozomální DNA těchto pěti izolátů s omezením na SpeI se lišily (obrázek 1). Bakterie byly uchovávány při -70 °C v infuzním bujónu srdce (Nissui Pharmaceutical, Tokio, Japonsko) obsahujícím 20 % glycerolu. Následně byly bakterie inokulovány na agarové desky s infuzním srdcem (Nissui Pharmaceutical) a inkubovány při 37 °C přes noc. MIC byly stanoveny agarovou ředicí metodou podle popisu Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), dříve National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS).14 Testování citlivosti bylo provedeno pomocí Mueller-Hintonova agaru (Nippon Becton Dickinson, Tokio, Japonsko) v souladu s pokyny výrobce. Interpretační kritéria MIC pro ceftazidim, imipenem, meropenem, norfloxacin, levofloxacin, gatifloxacin, gentamicin, amikacin a minocyklin se řídila kritérii CLSI/NCCLS.14 Breakpointy MIC ostatních antimikrobiálních látek nebyly stanoveny.
Antimikrobiální látky
Amplifikace a sekvenování DNA oblastí určujících rezistenci k chinolonům
Chromozomální DNA byla extrahována z izolátů P. putida, jak bylo popsáno dříve.15 Amplifikace PCR byla provedena pomocí specifických sad primerů. Sada primerů 5′-gacggcctgaagccggtgcac-3′ a 5′-gcccacggcgataccgctgga-3′ amplifikovala 417 bp fragment oblastí určujících rezistenci k chinolonům (QRDR) genu gyrA z pozic 115 až 531. Při použití primerů 5′-gacggcctgaagccggtgcac-3′ a 5′-gcccacggcgataccgctgga-3′ byla amplifikována část genu gyrA z pozic 115 až 531.16 Sada primerů 5′-agtacttcgccgacttcct-3′ a 5′-tacaggcgcgacaggcgctt-3′ amplifikovala 739 bp fragment QRDR genu gyrB z pozic 1073 až 1811.17 Sada primerů 5′-tctacgccatgagcgaactgg-3′ a 5′-agcagcacctcggaatagcg-3′ amplifikovala 262 bp fragment QRDR genu parC z pozic 158 až 419.18 Amplifikace byly provedeny pomocí enzymu Advantage-GC2 (BD Biosciences Clontech Japan, Tokio, Japonsko) podle pokynů výrobce. QRDR byly sekvenovány pomocí BigDye terminator v3.0 Taq cycle sequencing ready reaction kit s AmpliTaq DNA polymerázou (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) a automatického systému sekvenování DNA (ABI PRISM 310 genetic analyzer, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Genetická detekce genů pro metalo-β-laktamázy
Příprava proteinů vnější membrány
Proteiny vnější membrány (OMP) byly připraveny podle předchozího popisu.21 Vzorky byly analyzovány pomocí SDS-PAGE.
Výsledky
Citlivost
Výsledky testování citlivosti na fluorochinolony a karbapenemy jsou shrnuty v tabulkách 1 a 2. MIC β-laktamů se pohybovaly od >128 mg/l pro ampicilin a cefaloridin, 2 až >128 mg/l pro ceftazidim, 1 až 128 mg/l pro imipenem, 0,5 až >128 mg/l pro panipenem, 4 až >128 mg/l pro meropenem a 1 až >128 mg/l pro biapenem. Rozsahy MIC aminoglykosidů a minocyklinu byly následující: 0,25 až 8 mg/l pro gentamicin, 0,5 až 8 mg/l pro amikacin, 0,5 až 1 mg/l pro kanamycin a 4 až 64 mg/l pro minocyklin. Čtyři izoláty byly rezistentní nebo intermediární k fluorochinolonům i karbapenemům, zatímco jeden izolát, HU2001-429, byl citlivý k β-laktamům i fluorochinolonům. Tři izoláty P. putida, HU2001-412, HU2001-419 a HU2001-451, vykazovaly rezistenci ke všem zkoumaným β-laktamům, jako je ceftazidim, imipenem a meropenem. Tři izoláty, HU2001-412, HU2001-419 a HU2002-467, vykazovaly vysokou rezistenci na fluorochinolony (>128 mg/l), včetně norfloxacinu, levofloxacinu, sparfloxacinu, gatifloxacinu a pazufloxacinu, a také rezistenci na minocyklin (32 až 64 mg/l). U pěti izolátů se rozmezí MIC pro sitafloxacin pohybovalo mezi ≤0,125 a 8 mg/l.
Rezistence k fluorochinolonům
Rezistence ke karbapenemům
Z pěti izolátů P. putida nesly čtyři, které vykazovaly rezistenci ke karbapenemům, gen pro metalo-β-laktamázu typu IMP, zatímco geny pro metalo-β-laktamázu typu VIM nebyly pomocí PCR zjištěny (tabulka 2). Rozsahy MIC karbapenemů u P. putida nesoucí metallo-β-laktamázové geny typu IMP byly následující: 8 až 128 mg/l pro imipenem, 32 až >128 mg/l pro panipenem, 128 mg/l nebo více pro meropenem a 32 až >128 mg/l pro biapenem. U P. putida HU2001-451, který vykazoval nejvyšší MIC karbapenemů mezi pěti izoláty, byla produkce 46 kDa OMP pomocí SDS-PAGE nedetekovatelná, zatímco u P. putida HU2001-412, HU2001-419, HU2001-429 a HU2002-467 byla zjištěna podobně (tabulka 2).
Diskuse
V této studii jsme charakterizovali citlivost k fluorochinolonům a karbapenemům u pěti klinických izolátů P. putida izolovaných od různých pacientů s akutní, opakovanou nebo chronickou UTI. Všech pět izolátů vykazovalo různé genotypy PFGE, což naznačuje, že žádná z infekcí způsobených těmito P. putida nebyla nozokomiální. Čtyři z pěti izolátů byly rezistentní nebo intermediární k fluorochinolonům i karbapenemům. Tři izoláty vykazovaly vysokou rezistenci (>128 mg/l) ke všem zkoumaným fluorochinolonům s výjimkou sitafloxacinu. Z fluorochinolonů zkoumaných v této studii vykazoval sitafloxacin vyšší účinnost proti izolátům P. putida. Tyto izoláty vysoce rezistentní k fluorochinolonům byly rovněž rezistentní ke karbapenemům a minocyklinu. Všechny izoláty byly citlivé k aminoglykosidům, jako je amikacin.
Studie rezistence k fluorochinolonům u P. putida jsou omezené.6,12 U P. aeruginosa zahrnují hlavní mechanismy odpovědné za rezistenci k fluorochinolonům mutace aminokyselin v DNA gyráze nebo topoizomeráze IV způsobené mutacemi v QRDR GyrA a ParC, zatímco některé zprávy naznačují zapojení mutací GyrB do rezistence k fluorochinolonům.18,22 Sekundární mechanismus rezistence u P. aeruginosa, který zahrnuje efluxní systémy, přispívá ke snížené citlivosti k fluorochinolonům.22,23 V této studii byly porovnány aminokyselinové změny v QRDR GyrA, GyrB a ParC mezi pěti klinickými izoláty P. putida. P. putida rezistentní k fluorochinolonům měla další mutace, jako Thr-83→Ile v GyrA a Glu-469→Asp v GyrB, které odpovídaly mutacím nalezeným u P. aeruginosa rezistentní k fluorochinolonům.22,23 Tyto výsledky naznačují, že aminokyselinové mutace v QRDR, jako je Thr-83→Ile v GyrA a Glu-469→Asp v GyrB, mohou přispívat k vysoké rezistenci k fluorochinolonům, ačkoli nebylo stanoveno, zda by transformace plazmidy nesoucími geny gyrA, gyrB nebo parC divokého typu do těchto izolátů snížila MIC fluorochinolonů.24 Rozsah MIC sitafloxacinu byl u pěti izolátů P. putida mezi ≤0,125 a 8 mg/l. Ačkoli předchozí zprávy ukázaly, že nadměrná exprese efluxních systémů TtgABC, MepABC, TtgDEF a ArpABC může rovněž přispívat k rezistenci k více léčivům u P. putida,10,11,12 role efluxních systémů zůstala v této studii nejasná.
Byla popsána rezistence ke karbapenemům u P. putida způsobená produkcí metalo-β-laktamáz.3,4,8,9,9a Tyto metalo-β-laktamázy zjištěné u P. putida zahrnovaly IMP- a VIM-typy.3,4,8,9,9a U čtyř karbapenem-rezistentních P. putida byla produkce metalo-β-laktamáz zjištěna diskovou difuzní metodou (údaje nejsou uvedeny). Tyto izoláty nesly geny pro metallo-β-laktamázu typu IMP, zatímco geny pro metallo-β-laktamázu typu VIM nebyly pomocí PCR detekovány. Prevalence P. putida produkující metalo-β-laktamázu je důležitým klinickým problémem a představuje rezervoár genetických determinantů rezistence k β-laktamům. U P. aeruginosa patří mezi další hlavní mechanismy rezistence ke karbapenemům kromě produkce metalo-β-laktamáz také mutační nepropustnost vznikající ztrátou OprD – transmembránového kanálu tvořícího porin, který je přístupný karbapenemům, ale ne jiným β-laktamům21,25,26 . Ztráta OprD má za následek rezistenci k imipenemu a sníženou citlivost k meropenemu u P. aeruginosa.27 U P. putida HU2001-451, která vykazuje nejvyšší MIC (≥128 mg/l) ze všech karbapenemů mezi čtyřmi karbapenem-rezistentními izoláty, byla produkce 46 kDa OMP snížena ve srovnání s ostatními izoláty. Profily OMP u P. putida HU2001-451 byly podobné profilům karbapenem-rezistentní P. aeruginosa, u které byla v naší předchozí studii zjištěna snížená produkce OprD21. Tyto výsledky ukázaly kombinovaný vliv snížené produkce 46 kDa OMP koexistující s produkcí metalo-β-laktamáz na rezistenci ke karbapenemům u izolátu, ačkoli není jasné, zda mají pro rezistenci ke karbapenemům význam i jiné β-laktamázy.
Závěrem jsme charakterizovali rezistenci ke fluorochinolonům a karbapenemům u klinických izolátů P. putida. Naše výsledky naznačují, že aminokyselinové mutace v QRDR, jako je Thr-83→Ile v GyrA a Glu-469→Asp v GyrB, mohou přispívat k vysoké rezistenci k fluorochinolonům u P. putida. Čtyři izoláty P. putida produkující metalo-β-laktamázu, které vykazovaly rezistenci ke karbapenemům, nesly gen pro metalo-β-laktamázu typu IMP. Zjistili jsme kombinovaný účinek snížené produkce 46 kDa OMP a produkce metalo-β-laktamáz, který zvýšil rezistenci ke karbapenemům u izolátu P. putida vykazujícího nejvyšší MIC karbapenemů.
Děkujeme Miroku Medical Laboratory, Saku, Nagano, Japonsko, za PFGE analýzu. T. H. je podporován grantem Grant-in-Aid for Scientific Research (17790353) Ministerstva školství, kultury, sportu, vědy a technologie Japonska.
Martino R, Martínez C, Pericas R et al. Bacteremia due to glucose non-fermenting gram-negative bacilli in patients with hematological neoplasias and solid tumors.
;
:
-5.
Ladhani S, Bhutta ZA. Novorozenecká infekce Pseudomonas putida prezentující se jako stafylokokový syndrom opařené kůže.
;
:
-4.
Lombardi G, Luzzaro F, Docquier J-D et al. Nosokomiální infekce způsobené multirezistentními izoláty Pseudomonas putida produkujícími VIM-1 metallo-β-laktamázu.
;
:
-5.
Docquier J-D, Riccio ML, Mugnaioli C et al. IMP-12, nová plazmidem kódovaná metalo-β-laktamáza z klinického izolátu Pseudomonas putida.
;
:
-8.
Fass RJ, Barnishan J, Solomon MC et al. In vitro aktivity chinolonů, β-laktamů, tobramycinu a trimethoprim-sulfametoxazolu proti nefermentativním gramnegativním bacilům.
;
:
-8.
Rolston KVI, Messer M, Ho DH. Srovnání in vitro aktivity novějších chinolonů proti druhům Pseudomonas a Xanthomonas maltophilia izolovaným od pacientů s rakovinou.
;
:
-3.
Jones RN, Rhomberg PR, Varnam DJ et al. A comparison of antimicrobial activity of meropenem and selected broad-spectrum antimicrobials tested against multi-drug resistant Gram-negative bacilli including bacteraemic Salmonella spp: initial studies for the MYSTIC programme in India.
;
:
-31.
Lee K, Lim J, Yum JH et al. blaVIM-2 cassette-containing novel integrons in metallo-β-lactamase-producing Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas putida isolates disseminated in a Korean hospital.
;
:
-8.
Yomoda S, Okubo T, Takahashi A et al. Presence of Pseudomonas putida strains harboring plasmids bearing the metallo-β-lactamase gene blaIMP in a hospital in Japan.
;
:
-51.
Shibata N, Doi Y, Yamane K et al. PCR typing of genetic determinants for metallo-β-lactamases and integrases carried by Gram-negative bacteria isolated in Japan, with focus on the class 3 integron.
;
:
-13.
Fukumori F, Hirayama H, Takami H et al. Isolation and transposon mutagenesis of a Pseudomonas putida KT2442 toluene-resistant variant: involvement of an efflux system in solvent tolerance.
;
:
-400.
Ramos JL, Duque E, Godoy P et al. Efflux pumps involved in toluene tolerance in Pseudomonas putida DOT-T1E.
;
:
-9.
Kieboom J, de Bont JAM. Identification of molecular characterization of an efflux system involved in Pseudomonas putida S12 multidrug resistance [Identifikace molekulární charakterizace efluxního systému zapojeného do vícečetné lékové rezistence Pseudomonas putida S12].
;
:
-51.
Carmeli Y, Troillet N, Eliopoulos GM et al. Emergence of antibiotic-resistant Pseudomonas aeruginosa: comparison of risks associated with different antipseudomonal agents.
;
:
-74.
National Committee for Clinical Laboratory Standards. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically: Schválená norma M7-A6. NCCLS, Wayne, PA, USA,
.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press,
.
Kureishi A, Diver JM, Beckthold B et al. Cloning and nucleotide sequence of Pseudomonas aeruginosa DNA gyrase gyrA gene from strain PAO1 and quinolone-resistant clinical isolates.
;
:
-52.
Mouneimné H, Robert J, Jarlier V et al. Type II topoisomerase mutations in ciprofloxacin-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa.
;
:
-6.
Akasaka T, Onodera Y, Tanaka M et al. Cloning, expression, and enzymatic characterization of Pseudomonas aeruginosa topoisomerase IV.
;
:
-6.
Smazáno.
Poirel L, Naas T, Nicolas D et al. Characterization of VIM-2, a carbapenem-hydrolyzing metallo-β-lactamase and its plasmid- and integron-borne gene from a Pseudomonas aeruginosa clinical isolate.
;
:
-7.
Horii T, Muramatsu H, Morita M et al. Characterization of Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with urinary tract infections during antibiotic therapy.
;
:
-9.
Le Thomas I, Couetdic G, Clermont O et al. In vivo selection of a target/efflux double mutant of Pseudomonas aeruginosa by ciprofloxacin therapy.
;
:
-5.
Jalal S, Wretlind B. Mechanisms of quinolone resistance in clinical strains of Pseudomonas aeruginosa.
;
:
-61.
Cambau E, Perani E, Dib C et al. Role mutací v genech DNA gyrázy v rezistenci Pseudomonas aeruginosa citlivých nebo rezistentních k imipenemu vůči ciprofloxacinu.
;
:
-52.
Studemeister AE, Quinn JP. Selektivní rezistence k imipenemu u Pseudomonas aeruginosa spojená se sníženou propustností vnější membrány.
;
:
-8.
Livermore DM. Vícenásobné mechanismy antimikrobiální rezistence u Pseudomonas aeruginosa: naše nejhorší noční můra?
;
:
-40.
Livermore DM. O pseudomonádách, porinech, pumpách a karbapenemech.
;
:
-50.
Poznámky autorů
1Department of Laboratory Medicine, Hamamatsu University School of Medicine, 1-20-1 Handa-yama, Hamamatsu 431-3192, Japan; 2Group of Infection Control Research, Hamamatsu University School of Medicine, 1-20-1 Handa-yama, Hamamatsu 431-3192, Japan; 3Division of Pharmacy, Hamamatsu University School of Medicine, 1-20-1 Handa-yama, Hamamatsu 431-3192, Japonsko; 4Department of Clinical Laboratory Medicine, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 54 Shogoin-Kawahara-cho, Sakyo-ku, Kyoto 606-8507, Japonsko
.