Identifikace, charakterizace a ověření proteinů 130 a 131 jako 14-3-3
Obrázek 1.
Obrázek 1. Oblasti stříbrem natřených gelů zobrazující skvrny proteinů 130 a 131 po dvourozměrné elektroforéze.
Panel A zobrazuje normální mozkomíšní mok s nepřítomností skvrn 130 a 131. Panel B ukazuje mozkomíšní mok od pacienta s Creutzfeldt-Jakobovou chorobou; šipky ukazují na skvrny 130 a 131. Gely na panelech C a D pocházejí z extraktu normálního lidského mozku. Panely A, B a C ukazují stejnou oblast gelu s izoelektrickými body v rozmezí 4,8 až 6,0 (zleva doprava) na ose x a velikostí v rozmezí 10 až 40 kd (zdola nahoru) na ose y. Tečkovaný rámeček v panelu C ohraničuje oblast zobrazenou v panelu D z gelu s rozsahem pH 4,5 až 5,4. Šipky na panelech B a C označují umístění skvrn 130 a 131, které jsou označeny na panelu D.
Výsledky dvourozměrné elektroforézy pro detekci proteinů 130 a 131 mozkomíšního moku u pacientů s Creutzfeldt-Jakobovou chorobou jsou uvedeny na obrázcích 1A a 1B. Nedávná technická vylepšení vedla ke zvýšení rozlišení a místo původně popsaných dvou skvrn (odpovídajících proteinům 130 a 131) se objevilo šest. Abychom našli hojný zdroj těchto proteinů, zkoumali jsme normální mozkovou tkáň, abychom zjistili, zda se v blízkosti konstelace skvrn odpovídajících proteinům 130 a 131 v mozkomíšním moku nacházejí nějaké mozkové proteiny. Obrázek 1C ukazuje oblast stříbrem obarveného gelu po dvourozměrné elektroforéze normálních mozkových proteinů. Několik proteinů se objevuje ve stejné oblasti jako konstelace 130-131, včetně dvou, které mají stejný náboj a hmotnost jako konstelace 130-131 v mozkomíšním moku. Identifikace těchto dvou skvrn na základě jejich polohy byla potvrzena komigračními studiemi. Skvrna 130 byla přečištěna pomocí úzkorozsahové dvourozměrné elektroforézy (rozsah pH 4,5 až 5,4), jak je znázorněno na obrázku 1D.
Skvrna 130 byla vyříznuta z 10 skvrn, enzymaticky strávena a mikrosekvenována. Sekvence aminokyselin byly získány ze čtyř peptidových fragmentů. Tři z těchto sekvencí, Val-Thr-Glu-Leu-Asn-Glu-Pro-Leu-Xaa-Asn-Glu-Asp-Xaa-Asn-Leu-Leu-Ser-Val-Ala, Asp-Tyr-Tyr-Xaa-Tyr-Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Gly-Glu-Lys a Asn-Val-Val-Xaa-Ala-Arg-Arg-Ser-Ser-Xaa-Arg-Val-Ile-Ser-Ser-Ile-Glu-Gln, odpovídaly sekvenci lidského proteinu 14-3-3, izoforma eta. Čtvrtá sekvence, Tyr-Ser-Glu-Ala-Xaa-Glu-Ile-Ser, odpovídala hovězímu proteinu 14-3-3, izoformě gama.
Protilátka proti proteinu 14-3-3 reagovala specificky s proteiny 130 a 131 mozkomíšního moku na dvourozměrném elektroforetickém imunoblotu, ale nereagovala s jinými proteiny mozkomíšního moku, čímž se ověřilo, že proteiny 130 a 131 mozkomíšního moku jsou proteiny 14-3-3.
14-3-3 Imunoanalýza
Obrázek 2. Obrázek 3: Imunoanalýza proteinu 14-3-3.
Obrázek 2. Imunobarvení pro polyklonální králičí protilátku Anti-14-3-3β po elektroforéze s dodecylsulfátem sodným a polyakrylamidovým gelem.
Pruh 1 ukazuje mozkomíšní mok od pacienta s patologickými známkami Alzheimerovy choroby, pruhy 2 a 3 ukazují mozkomíšní mok od dvou pacientů s Creutzfeldt-Jakobovou chorobou, pruh 4 ukazuje mozkomíšní mok od normální krávy, pruh 5 ukazuje mozkomíšní mok od krávy s experimentálně vyvolanou přenosnou encefalopatií norka a patologickými známkami spongiformního onemocnění, pruh 6 ukazuje normální lidské sérum, pruh 7 ukazuje sérum pacienta s Creutzfeldt-Jakobovou chorobou, pruh 8 ukazuje extrakt z normálního lidského mozku a pruh 9 ukazuje purifikovaný prionový protein z mozku pacienta s Creutzfeldt-Jakobovou chorobou.
Objev, že skvrny 30-kd v mozkomíšním moku (proteiny 130 a 131) jsou proteiny 14-3-3, vedl k vývoji jednoduchého imunoanalýzy, která pomáhá při diagnostice přenosné spongiformní encefalopatie. Jak ukazuje obrázek 2, v mozkomíšním moku od pacientů s Creutzfeldt-Jakobovou chorobou byl zjištěn imunoreaktivní pás 30-kd (pruhy 2 a 3), zatímco v mozkomíšním moku od zdravých kontrol (údaje nejsou uvedeny) nebo od pacienta s Alzheimerovou chorobou (pruh 1) nebyl takový pás zjištěn. Podle očekávání byl protein 14-3-3 hojně zastoupen v extraktu normálního lidského mozku (pruh 8). protein 14-3-3 nebyl nalezen v normálním séru (pruh 6); nebyl však detekován ani v séru pacientů s Creutzfeldt-Jakobovou chorobou (pruh 7). Prionový protein purifikovaný z mozku pacienta s Creutzfeldt-Jakobovou chorobou (pruh 9) nereagoval křížově s protilátkou 14-3-3, což potvrzuje, že 14-3-3 není prionový protein.
Tabulka č. 1.
Tabulka 1. Vzorky mozkomíšního moku hodnocené pomocí imunoanalýzy 14-3-3 podle diagnózy. Tabulka 2.
Tabulka 2. Citlivost a specifičnost imunoanalýzy 14-3-3 pro Creutzfeldt-Jakobovu nemoc.
Šedesát osm ze 71 vzorků mozkomíšního moku od pacientů s Creutzfeldt-Jakobovou chorobou (96 %) bylo pozitivních na 14-3-3 (tabulka 1 a tabulka 2). Čtyři z 94 vzorků (4 %) od pacientů s jinými chorobami zahrnujícími demenci byly pozitivní na 14-3-3 (tabulka 1 a tabulka 2) (P<0,001). Navíc, když byli z analýzy vyloučeni pacienti s demencí, o nichž bylo známo, že prodělali akutní infarkt mozku během jednoho měsíce před testováním, byl pozitivní pouze 1 z 91 vzorků (1 %) (P<0,001). Vzorky od všech 10 pacientů s multiinfarktovou demencí, ale bez mozkové příhody v měsíci před testováním, byly na přítomnost 14-3-3 negativní. Jediný falešně pozitivní výsledek mezi vzorky mozkomíšního moku od ostatních pacientů s demencí pocházel od pacienta s klinickou diagnózou Alzheimerovy choroby, která nebyla ověřena patologickými studiemi.
14-3-3 byl zjištěn v 18 z 66 vzorků mozkomíšního moku (27 procent) od pacientů s jinými neurologickými onemocněními nezahrnujícími demenci. Těchto 18 pozitivních vzorků pocházelo od pacientů s akutní virovou encefalitidou, cévní mozkovou příhodou (bez demence) během jednoho měsíce před testováním, subarachnoidálním krvácením nebo Rettovým syndromem. Creutzfeldt-Jakobovu chorobu nebylo možné rozumně zahrnout do diferenciální diagnózy žádné z těchto poruch.
Celkově byla citlivost imunoanalýzy 14-3-3 jako markeru Creutzfeldt-Jakobovy choroby 96 % (68 pravdivě pozitivních výsledků děleno 71 pravdivě pozitivními a falešně negativními výsledky; 95 % interval spolehlivosti, 92 až 99 %) a specificita 88 % (164 pravdivě negativních výsledků děleno 186 pravdivě negativními a falešně pozitivními výsledky; 95 % interval spolehlivosti, 84 až 92 %). Ještě důležitější je, že specificita tohoto testu mezi všemi pacienty s demencí byla 96 % (90 pravdivě negativních výsledků děleno 94 pravdivě negativními a falešně pozitivními výsledky; 95 % interval spolehlivosti, 90 až 96 %), a když byli vyloučeni tři pacienti s demencí a mozkovým infarktem během jednoho měsíce před testováním, specificita imunoanalýzy byla 99 % (90 pravdivě negativních výsledků děleno 91 pravdivě negativními a falešně pozitivními výsledky; 95 % interval spolehlivosti, 97 až 100 %) (tabulka 1 a tabulka 2).
Srovnání dvourozměrné elektroforézy a imunoanalýzy
Tabulka 3.
Tabulka 3. Srovnání dvourozměrné elektroforézy pro proteiny 130 a 131 a imunoanalýzy 14-3-3.
Srovnávali jsme dvourozměrnou elektroforetickou analýzu pro proteiny 130 a 131 s imunoanalýzou 14-3-3 u 50 vzorků mozkomíšního moku (tabulka 3). Třináct z patnácti vzorků od pacientů s Creutzfeldt-Jakobovou chorobou bylo pozitivních při obou testech a další dva vzorky byly negativní na proteiny 130 a 131, ale pozitivní na protein 14-3-3. V obou testech jsme zjistili pozitivní výsledky. Výsledky obou testů byly stejné u vzorků od pacientů s demencí nesouvisející s Creutzfeldt-Jakobovou chorobou nebo jinými neurologickými poruchami. Ačkoli jsou specifity obou testů podobné, imunoanalýza 14-3-3 má mírně vyšší citlivost.
Imunologická analýza 14-3-3 u zvířat
Tabulka 4.
Tabulka 4. Výsledky imunoanalýzy 14-3-3 ve vzorcích mozkomíšního moku od zvířat.
Výsledky studií na zvířatech se shodovaly s výsledky studií na lidech. Obrázek 2 ukazuje výsledky testu v mozkomíšním moku od normální krávy (pruh 4) a krávy s patologickými známkami přenosné spongiformní encefalopatie (pruh 5). Jak ukazuje tabulka 4, protein 14-3-3 byl zjištěn v mozkomíšním moku u šesti z devíti kusů skotu s experimentálně vyvolanou přenosnou spongiformní encefalopatií nebo klusavkou. Jedna kráva s klinickými příznaky, ale bez patologických důkazů přenosné spongiformní encefalopatie, měla rovněž pozitivní test. Žádný kontrolní skot neměl pozitivní testy. Test byl pozitivní u pěti ze šesti ovcí s přirozeně získanou klusavkou a byl negativní u jedné kontrolní ovce. Všech 15 experimentálně infikovaných šimpanzů mělo pozitivní testy, zatímco žádný ze 77 kontrolních šimpanzů je neměl. Celková citlivost imunoanalýzy 14-3-3 u zvířat byla 87 % a celková specifičnost 99 %.
.