Biofyzik Adam Cohen se v roce 2010 procházel po San Francisku v Kalifornii, když ho překvapil telefonát. „Máme signál,“ řekl volající. Téměř 5 000 kilometrů odtud, v Cambridge ve státě Massachusetts, narazili jeho spolupracovníci na zlatou žílu. Po měsících neúspěšných pokusů vědci našli fluorescenční protein, který jim umožnil sledovat signály, jak procházejí mezi neurony.
Ale dělo se tu něco divného. Když se Cohen vrátil do své laboratoře na Harvardově univerzitě, zjistil, že všechny záznamy z experimentu vykazují podivný průběh. Nejprve neurony ozdobené proteinem pěkně blikaly, jak jimi svištěly elektrické impulsy. Pak se ale buňky změnily v jasné skvrny. „V polovině každého záznamu signál zdivočel,“ říká Cohen.
Při experimentu se proto rozhodl připojit ke svému týmu. „Když začali nahrávat, seděli tam se zatajeným dechem,“ říká Cohen. Ale jakmile zjistili, že to funguje, oslavovali, „tančili a běhali po místnosti“.
V rozjaření nechávali světlo ze stolní lampy svítit přímo na mikroskop. „Vlastně jsme si své nadšení nahrávali,“ říká Daniel Hochbaum, tehdy postgraduální student v Cohenově skupině. Zklidnili své oslavy a o rok později tým publikoval svou studii1 – jednu z prvních, která ukázala, že fluorescenční protein zabudovaný do specifických savčích neuronů lze použít ke sledování jednotlivých elektrických impulzů v reálném čase.
Neurovědci se již desítky let snaží pozorovat rychlé elektrické signály, které jsou hlavní součástí mozkové řeči. Přestože elektrody, pracovní koně pro měření napětí, dokáží spolehlivě zaznamenat aktivitu jednotlivých neuronů, mají problém zachytit signály mnoha z nich, zejména po delší dobu. V posledních dvou desetiletích však vědci našli způsob, jak zabudovat fluorescenční proteiny indikující napětí přímo do buněčných membrán neuronů. Se správným typem mikroskopu pak mohou vidět, jak se buňky rozsvěcují, když spolu hovoří – ať už šeptem, nebo křikem. Zobrazování napětí může také zaznamenávat elektrickou konverzaci mezi mnoha neurony najednou a poté tyto signály zprůměrovat ve velkých částech mozkové tkáně. To pomáhá vědcům studovat elektrickou aktivitu mozku v různých prostorových měřítkách, přičemž mohou naslouchat nejen hlasům jednotlivých buněk, ale také „řevu davu“, říká Cohen.
Za posledních 5 let vědci publikovali na toto téma asi 1 000 prací a velké programy financování, jako je iniciativa BRAIN amerického Národního institutu zdraví, urychlily vývoj nových typů geneticky upravených indikátorů napětí. V naději, že se podaří najít lepší varianty, přišly některé skupiny se strategiemi, jak prověřit miliony proteinů z hlediska požadovaných vlastností, jako je například jas. Jeden takový přístup identifikoval indikátor, který je dvakrát jasnější než podobné senzory vyvinuté o pouhé čtyři roky dříve2.
Jakmile se tyto proteiny zdokonalí a pokrok v mikroskopii usnadní jejich pozorování, vědci doufají, že osvětlí největší hádanku neurovědy: jak mozkové buňky spolupracují, aby přeměnily systém elektrických impulzů na myšlenky, činy a emoce. Vědci se stále snaží zachytit celou škálu aktivit a vymyslet způsoby, jak vidět nervy, které rychle a hluboko v mozkové tkáni pracují. Pokud by však pokrok dokázal tyto technické problémy vyřešit, „bylo by to revoluční“, říká Rafael Yuste, který studuje funkci nervových obvodů na Kolumbijské univerzitě v New Yorku.
Vysokorychlostní proces
Průměrný lidský mozek obsahuje asi 120 miliard neuronů, které neustále přijímají a vysílají informace prostřednictvím větvících se výběžků zvaných dendrity. Chemické nebo elektrické signály, které se dostanou k dendritům, vyvolávají malé změny napětí na membráně buňky, které jsou vedeny do jejího těla. Když součet napěťových změn dosáhne bodu, z něhož není návratu, tzv. prahu, neuron vystřelí velký elektrický výboj – akční potenciál. Tento vzruch sviští rychlostí až 150 metrů za sekundu podél neuronální větve, zvané axon, k dalšímu souboru rozvětvených výběžků. Zde chemické nebo elektrické signály předají informaci další sadě dendritů.
Neuronální signály se sbíhají, rozcházejí a synchronizují, aby vytvořily symfonii myšlenek, emocí, akcí a reakcí, od zrudnutí tváře po dětské škytnutí. Poslechové nástroje vědců jsou však velmi omezené. Miniaturní elektrody tenké jako vlas, které byly poprvé vyvinuty ve 40. letech 20. století, lze zavést do mozku proti neuronům nebo do jejich nitra, kde s přesností a rychlostí měří membránové napětí. Tento přístup však lze použít ke sledování pouze jednoho nebo několika neuronů najednou – a pouze po omezenou dobu, protože elektrody nakonec buňku poškodí. Je to jako snažit se pochopit podstatu orchestrálního aranžmá sledováním jednoho hráče po dobu několika sekund.
Svazky mikroelektrod mohou zaznamenávat elektrickou aktivitu až 200 buněk najednou, ale protože jsou tyto elektrody umístěny v blízkosti neuronů, nikoliv uvnitř nich, mohou detekovat pouze akční potenciály, nejostřejší výboje elektrické aktivity. Jsou hluché k jemnějším tónům – malým elektrickým změnám, které nepostrčí neuron až k akčnímu potenciálu. Tyto podprahové změny napětí jsou pro funkci mozku klíčové, protože se postupně sčítají a rozhodují o tom, zda neuron vystřelí, nebo ne.
V naději, že se podaří měřit klidnější mozkovou aktivitu ve větších populacích buněk, si vědci v 60. letech začali pohrávat s myšlenkou senzoru nebo sondy, která by v reakci na elektrický signál fluoreskovala. Nejoblíbenější sondy, nazývané indikátory vápníku, se rozsvítí, když se naváží na vápník, který proudí do neuronu v důsledku nárůstu elektrické aktivity. Tato technika, známá jako zobrazování vápníku, však poskytuje pouze zástupný údaj; nezaznamenává přímo membránové napětí. A přestože zobrazí signál velkých událostí, jako jsou akční potenciály, přehlédne věci, které jsou pro funkci mozku klíčové, jako jsou jemné výkyvy membránového napětí nebo elektrické signály, které akční potenciály brzdí. Představte si, že byste po symfonickém koncertu slyšeli jen výbuch potlesku: je jasné, že orchestr hrál, ale co hrál, to se nikdo nedozví.
V 70. letech 20. století začali vědci vyvíjet barvivové senzory, které přímo detekují změny membránového napětí. První verze těchto barviv musely být na mozek nanášeny bez rozdílu, takže označovaly všechny typy buněk, včetně buněk ne-neuronálních, což ztěžovalo rozebírání aktivity konkrétních neuronů.
Poté, v 90. letech 20. století, začali vědci testovat indikátory, které mohly být geneticky upraveny tak, aby se objevovaly pouze v neuronech, které je zajímají. První3 geneticky kódovaný indikátor napětí (GEVI) byl vyvinut v roce 1997; od té doby vědci vychrlili více než dva tucty senzorů4. Některé z nich jsou vyrobeny kombinací proteinu citlivého na napětí s fluorescenčními molekulami (viz „Chuť fluorescence“). Když tyto proteiny detekují změnu napětí, změní svou 3D strukturu a změní fluorescenci molekuly, se kterou jsou spojeny. Dalšími indikátory napětí jsou zmutované verze mikrobiálních rodopsinů, fluorescenčních molekul, které v reakci na světlo způsobují změnu napětí na plazmatické membráně. Tyto proteiny mohou fungovat i obráceně a měnit svou reakci na světlo – a tím i fluorescenci – v reakci na změnu membránového napětí.
Vše v detailu
Dosud se GEVI osvědčily při sledování jednotlivých akčních potenciálů jak v kultivovaných neuronech, pěstovaných na misce, tak v intaktních mozcích celé řady živočichů, od hmyzu5 po myši6. Jedním z největších příslibů této techniky je její potenciál zaznamenávat nejen velké události, ale také malé, podprahové změny membránového napětí, které odrážejí zprávy, jež neuron přijímá od sousedních buněk, říká Cohen. „Zobrazování napětí umožňuje sledovat vstupy do neuronů in vivo, což jsme dříve neměli jak sledovat,“ říká.
V minulém roce Cohen se svými kolegy vyvinul nové GEVI a zdokonalil mikroskopické techniky, které umožňují zaznamenávat takové podprahové změny napětí z mnoha neuronů najednou, a to i v myším mozku7,8 . Tým byl také schopen zaznamenat elektrickou aktivitu stejných neuronů až o týden později. Schopnost přesně vědět, které neurony jsou zaznamenávány, a sledovat je v průběhu času umožňuje vědcům podívat se na propojení mezi těmito neurony, říká Ed Boyden, neurolog z Massachusettského technologického institutu v Cambridge. Tímto způsobem „můžete propojit strukturu mozku s jeho funkcí“, říká. „To je jedna z klíčových otázek celé neurovědy.“
Další výhodou GEVI je, že na rozdíl od elektrod, které zaznamenávají hlavně signály z buněčného těla, mohou zaznamenávat elektrické signály z kterékoli části nervové buňky, až po špičky dendritů (viz „Úder na váhu“). To je, jako kdybyste mohli poslouchat konkrétně tóny, které hraje levá ruka klavíristy. „O tomhle jsem snila už dlouho – a nejsem sama,“ říká Katalin Tothová, neurobioložka z Lavalovy univerzity v kanadském Quebecu. Mnoho neurovědců se podle ní snaží sledovat napětí napříč celými neurony, aby zjistili, jak se mění v různých oblastech buňky.
Wei Wei, neurobiolog z Chicagské univerzity v Illinois, používá GEVI, aby zjistil, jak se v neuronech myší sítnice integrují různé elektrické vstupy. Wei se zajímá o třídu neuronů, které silněji reagují na zrakové podněty, když se pohybují určitým směrem. Sledováním změn membránového napětí v různých částech těchto neuronů doufá, že pochopí, jak buňky shrnují příchozí signály, aby zjistily směr pohybu.
Neurofyziolog Vincent Villette z Ecole Normale Supérieure v Paříži plánuje pomocí napěťových senzorů studovat, jak pravidelné fluktuace podprahových elektrických signálů určují, jak neurony v myším mozečku koordinují svalovou činnost. „Je toho hodně, co je třeba pochopit o tom, jak spolu buňky jednají,“ říká Villette.
Získání vizuálního odečtu membránového napětí také umožňuje vědcům vidět elektrické signály, které spíše inhibují vypalování neuronů, než aby je spouštěly. Protože inhibiční signály není možné zaznamenat pomocí přístupů, jako je zobrazování vápníku, není jasné, jak přesně utvářejí mozkovou aktivitu, říká Rosa Cossartová, neurobioložka ze Středomořského neurobiologického institutu v Marseille ve Francii.
Cossartová již léta používá elektrody a zobrazování vápníku, ale nyní by ráda vyzkoušela GEVI. Doufá, že jí tyto senzory umožní měřit napětí vysokou rychlostí na více neuronech – nejméně 50 – najednou u živé myši. To by podle ní pomohlo pochopit, jak skupiny neuronů integrují elektrické signály – excitační i inhibiční – a podporují tak činnosti, které jsou klíčové pro vývoj a funkci mozku.
Hluboké problémy
Přes velká očekávání může být zprovoznění GEVI v laboratoři problém. Například Helen Yangová: jako postgraduální studentka kalifornské Stanfordovy univerzity se rozhodla vyzkoušet GEVI jako způsob studia neuronů ve zrakovém systému ovocné mušky. Při prvním experimentu však Yangová při pohledu do mikroskopu nezaznamenala žádnou změnu ve fluorescenci buněk, a to ani tehdy, když mouchám do očí posvítila jasným světlem. Teprve při analýze dat si uvědomila, že zrakové podněty vytvářejí signál, jenže nepatrný. „Byla jsem docela nadšená, ale moji kolegové v laboratoři už méně,“ říká. „Odezvy byly dost malé a hlučné.“
Yang si začala hrát s nastavením mikroskopu, zvyšovala výkon laseru a zrychlovala zobrazování. „V podstatě jsem zařídila, aby to šlo tak rychle, jak to náš mikroskop dokáže,“ říká. To proto, že reakce indikátoru na elektrický signál byla tak rychlá, že změnu fluorescence bylo možné zaznamenat jen na zlomek sekundy. „Pokud během doby, kdy buňka reaguje, zachytíte pouze jeden snímek, odpověď vůbec nevypadá velká,“ říká Yangová.
Yangové se nakonec podařilo použít GEVI ke zkoumání toho, jak muší neurony zpracovávají vizuální podněty5, ale druhy problémů, kterým čelila, zatím brání tomu, aby se napěťové zobrazování stalo běžnou technikou. Podle Cohena vyžaduje pokročilé, často na míru postavené mikroskopické platformy. „Nemůžete to dělat jen tak na fluorescenčním mikroskopu po babičce.“
V posledních pěti letech finanční podpora z iniciativy BRAIN podpořila pokrok v této oblasti, včetně vývoje lepších GEVI, říká Michael Lin, proteinový inženýr ze Stanfordu.
Souběžně s vývojem nových senzorů pracují vědci na technikách přesného zobrazování rychlých elektrických signálů procházejících mozkem. Jedním z problémů je, že většina dostupných technik funguje dobře pouze s buňkami v misce nebo na povrchu mozku. Mozek savců však není průhledný: ve skutečnosti vypadá jako tofu, říká Na Ji, fyzik z Kalifornské univerzity v Berkeley.
Chce-li vědec nahlédnout hlouběji, musí se obrátit k invazivnějším metodám, jako je odstranění části nadložní tkáně nebo zapíchnutí drobných optických zařízení zvaných mikroendoskopy přímo do mozku. Alternativním, neinvazivním způsobem, jak nahlédnout do neprůhledných tkání – až 1 milimetr hluboko – je dvoufotonová mikroskopie. Tato technika využívá světlo o delší vlnové délce a nižší energii, které může proniknout hlouběji do tkání. Protože dvoufotonové mikroskopy osvětlují a zaznamenávají pouze z jednoho místa najednou, pořizují snímky příliš pomalu na to, aby bylo možné sledovat většinu rychlého chodu mozku. Odborníci jsou však přesvědčeni, že pokrok v této technologii brzy umožní sledovat signály produkované GEVI vyšší rychlostí. „Je to naprosto proveditelné,“ říká Ji.
Pokud se různým přístupům podaří překonat tyto problémy, vědci nepochybují o tom, že se napěťové zobrazování stane standardním přístupem k měření mozkové aktivity. „V příštím roce nebo dvou uvidíme spoustu prací, které aplikovaly napěťové senzory a dozvěděly se něco o biologii,“ říká Thomas Clandinin, neurobiolog ze Stanfordu. Podle některých názorů by tato technika mohla dokonce nahradit elektrody v otázkách souvisejících s tím, jak neurony zpracovávají a integrují informace.
Výzkumníci na počátku kariéry jsou obzvláště optimističtí: Hochbaum, který je nyní postdoktorandem na Harvard Medical School v Bostonu, říká, že v dlouhodobém horizontu bude GEVI nástrojem pro studium toho, jak různé oddíly v buňce reagují na podprahové signály. Plánuje využít zobrazování napětí k pochopení toho, jak takové signály mění spojení mezi neurony, což je klíčový proces při učení. Možnosti jsou vzrušující, říká Hochbaum, ale z těch prvních dnů, kdy poskakoval po laboratoři v záři poté, co spatřil záři v mikroskopu, si odnesl přinejmenším jednu důležitou lekci: když experimenty fungují, omezte oslavy na minimum.