Purifikace jednovláknové DNA kopolymerizací s akrylamidem a elektroforézou

Jednovláknová DNA (ssDNA) je užitečná pro aptamery (1), samosestavování (2), DNA origami (3), DNA obvody (4), hybridizační sondy (5) a DNA robotiku (6). Chemicky syntetizovaná DNA je standardně jednovláknová.

Představujeme zde metodu výroby ssDNA z produktu PCR. Použití produktu PCR namísto syntetické DNA může být výhodné, protože PCR zavádí méně mutací než chemická syntéza a může vytvářet DNA delší, než je limit ∼120 bází pro chemickou syntézu. Produkty PCR vycházející z klonálního vzorku mohou mít také výrazně vyšší sekvenční čistotu než chemicky syntetizovaná DNA. Vysoká čistota sekvence je rozhodující pro vysoký výkon v technologii DNA obvodů (7).

Naše metoda generování jednoho řetězce (SSG) je škálovatelná a vyžaduje pouze jeden purifikační krok. Tím se odstraní nežádoucí komplementární vlákno a provede se čištění na základě velikosti od zbytkového primeru a nežádoucích produktů PCR. SSG pomocí kopolymerizace a elektroforézy lze použít na produkt pokročilých protokolů PCR, jako je Gibsonova montáž (8), k vytvoření dlouhých jednovláknových produktů libovolné sekvence. To může být užitečné pro DNA origami a další aplikace samosestavování.

SSG využívá komerčně dostupnou modifikaci DNA známou jako akridit. Tato modifikace přidává polymerizovatelnou vinylovou skupinu, která se začlení do rostoucího polymerního řetězce akrylamidu (9). DNA modifikovaná akrycitem byla použita pro řadu aplikací, včetně přepínatelného hydrogelu (10), záchytu rtuti (11) nebo PDGF (12) a pro modifikaci rychlosti elektroforézy specifických sekvencí (13). Naše technika je povrchně podobná metodě, kterou Churchova skupina imobilizovala kolonie polymerázy v tenkých polyakrylamidových gelech. Akridit je rozhodující pro tvorbu klonálních produktů PCR (polonií) při některých formách sekvenování DNA (14).

V případech, kdy je zapotřebí značné množství čisté ssDNA, je náš přístup využívající akriditem modifikované primery a polyakrylamidovou imobilizaci vhodnou volbou. Ukazujeme také, že tato technika může integrovat SSG, separaci velikosti a elektroeluci do jediného kroku.

Materiály a metody

Není-li uvedeno jinak, činidla byla získána od společnosti Sigma Aldrich (St. Louis, MO) a použita bez dalšího čištění. DNA byla získána od IDT (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) a použita bez dalšího čištění (informace o sekvenci viz doplňková tabulka S1).

Demonstrace zachycení akrylátového vlákna

Pro počáteční demonstraci SSG pomocí kopolymerizace s akrylamidem a následné elektroforézy jsme upravili jeden primer s akrylátem a červeným fluorescenčním barvivem Cy5. Druhý primer byl zakoupen se zelenou fluorescenční modifikací 5′ fluoresceinu. Obrázek 1 ukazuje, jak byl připraven vzorek DNA smícháním 100 μl 10% denaturačního gelu (prepolymer před zahájením polymerace) se 100 μl produktu PCR (∼20 pMol produktu) a příslušnou hmotností suché močoviny (5% konečná koncentrace akrylamidu, 7 M konečná koncentrace močoviny). DNA/prepolymer byl vložen do suché jamky 5% denaturačního PAGE gelu. Gel se zahřál, jak je popsáno níže, a provedla se elektroforéza, aby se oddělilo zelené fluorescenční vlákno od imobilizovaného červeného fluorescenčního vlákna. Výsledný gel byl zobrazen pomocí standardního systému pro zobrazování gelu s osvětlením LED (FluorChem Imaging System, Protein-Simple, San Jose, CA).

Generace a čištění jednovláknového produktu (vertikální gelová elektroforéza)

PCR byla ve všech případech provedena pomocí reakční soupravy Accuprime Pfx (Life Technologies, Grand Island, NY) s použitím 50 nM templátu, 10 μM každého primeru a 8 tepelných cyklů. Produkt PCR byl denaturován přidáním pevné močoviny na konečnou koncentraci 7 M ve 100 μl reakce. Polyakrylamid byl připraven z komerčně získaného zásobního roztoku 40% akrylamidu ve vodě s poměrem akrylamid:bis-akrylamid 19:1 (Bio-Rad, Hercules, CA). Denaturační polyakrylamid byl připraven s konečnou koncentrací 7 M močoviny, 20% akrylamidu a 0,25× TBE pufru. Polymerizace byla zahájena přidáním 1 μl TEMED (N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamin) a 10 μl 10% persíranu amonného k alikvotní části 1 ml denaturačního akrylamidového prepolymeru. Část této směsi (prepolymer před zahájením polymerace) byla rychle smíchána v poměru 1:1 se 100 μl PCR produktu (pět 20 μl PCR reakcí podle pokynů výrobce, spojených) se 7 M močovinou (10% akrylamid, konečná koncentrace). Směs PCR/polymerujícího akrylamidu byla přidána do suché jamky ve standardním vertikálním denaturačním PAGE gelu. Úplná polymerace PCR/denaturačního akrylamidu byla zajištěna proplachováním prostoru nad jamkou mírným proudem argonu nebo 99,97% dusíku (k vytěsnění veškerého kyslíku, který polymeraci inhibuje). Po ∼30 minutách polymerace jsme nastavili elektroforetické zařízení. Rozdrcení polyakrylamidu a vložení macerovaných kousků do jamky vedlo k vytvoření velmi širokého, nepravidelně tvarovaného pásu, proto bylo od tohoto postupu upuštěno (údaje nejsou uvedeny). Polymerizace v jamce byla lepším přístupem. Zahřáli jsme provozní pufr v mikrovlnné troubě k varu a horký (∼80-90 °C) pufr jsme přidali do katodového rezervoáru (nalitím horkého pufru na naplněné jamky), abychom podpořili uvolnění DNA z jamky. V přidávání horkého pufru se pokračovalo, dokud se gelová souprava nenaplnila na objem potřebný pro elektroforézu. Gel obsahující DNA byl při aplikaci napětí v přímém kontaktu s horkým pufrem. Horký pufr by se měl aplikovat okamžitě a neměl by se nechat vychladnout. Poté jsme provedli elektroforézu podle schématu uvedeného na obrázku 1.

Jako provozní pufry lze použít pufry SB (5 mM boritan sodný) a TBE. SB a TBE byly připraveny při RT o pH 8,42, resp. 8,36. V obou případech se jednalo o pufry. Při 80 °C se tyto hodnoty pH mění na 8,21, resp. 7,47. Tato změna pH je přechodná. Gel se během elektroforézy ochladí na 30-40 °C. Tato změna pH nezpůsobila znatelnou degradaci DNA.

Pro vizualizaci oddělení dvou vláken jsme použili primery modifikované dvěma různými fluorofory. Pohyblivé vlákno bylo vytvořeno pomocí primeru modifikovaného fluoresceinem. Primer (akridit) pro nepohyblivé vlákno byl připraven s vnitřní modifikací Cy5. Pomocí těchto dvou barviv jsme mohli vizualizovat průběh separace. Tento gel jsme skenovali pomocí gelového zobrazovače (FluorChem Q, ProteinSimple, Santa Clara, CA) po 45 minutách elektroforézy při 500 V.

Jako alternativní přístup lze produkt PCR předkoncentrovat standardním srážením etanolem. Pelet lze poté rozpustit v menším objemu akrylamidového prepolymeru. V našich rukou byla zvýšená koncentrace v jamce kompenzována ztrátami během srážení. V některých případech (např. u slabého proužku produktu) může být tento postup upřednostněn.

Fluorescenční proužek nesoucí jednovláknový, fluoresceinem modifikovaný produkt byl z gelu vyříznut pod modrým osvětlením LED při ∼475 nm (Bulldog Bio, Portsmouth, NH). DNA byla eluována standardní metodou crush and soak (15). Pokud byla eluovaná (získaná) DNA příliš zředěná pro účinné srážení etanolem, zahustili jsme ji extrakcí butanolem. Produkt byl poté vysrážen ethanolem a dále analyzován, jak je uvedeno níže.

PAGE analýza

Fluoresceinem značené jednořetězcové produkty (ssDNA uvolněná denaturační PAGE) byly analyzovány na čistotu pomocí nativní PAGE. Jednovláknový produkt jsme resuspendovali v 10 μl a kvantifikovali pomocí UV-Vis spektroskopie. Připravili jsme stejné molární koncentrace primeru a jednořetězcového produktu a tyto vzorky a 25bp zelený fluorescenční žebřík (Jena Bioscience, Jena, Německo) jsme elektroforézovali na 15% nativním PAGE gelu, který byl vizualizován pomocí Stormova skeneru pro fluoresceinový signál.

Quencherová analýza

Pro další zjištění, že produkt je skutečně jednovláknový, jsme testovali hybridizaci komplementárního oligonukleotidu (quench sonda) obsahujícího modifikaci 3′ quencher. Při správné hybridizaci umístí quench sonda Iowa Black quencher do vzdálenosti několika nanometrů od 5′ fluoresceinové modifikace na komplementárním řetězci. To způsobí prudký pokles intenzity fluorescence. Zhášecí sonda hybridizuje pouze s ssDNA. Pokud je produkt dvouřetězcový, hybridizace bude blokována a fluorescence nebude ovlivněna. V PCR zkumavkách byly připraveny trojnásobné 10 μl vzorky 100 nM fluoresceinem modifikovaných produktů (PCR produkt, SSG produkt a kontrolní primer). Tyto vzorky byly změřeny fluorometrem QuantiFluor (Promega, Madison, WI) pro počáteční hodnoty fluorescence a poté bylo přidáno 1,1 molárního ekvivalentu zhášecí sondy DNA, promícháno, odstředěno a ponecháno v inkubaci po dobu přibližně 1 min. Poté byla zaznamenána fluorescence, aby se zjistilo, zda došlo ke zhášení.

Srovnání technik generování jednoho řetězce pro výrobu aptamérů

Abychom zjistili účinnost této metody pro generování funkčních aptamérů, zakoupili jsme templát pro PCR amplifikaci známé sekvence aptaméru vážícího lysozym. Tento templát jsme amplifikovali pomocí fluoresceinem modifikovaného primeru a akriditem modifikovaného reverzního primeru. Protokol SSG jsme provedli, jak je popsáno výše. Konjugovali jsme lysozym s 5,8 μm kuličkami modifikovanými karboxylátem (Bangs Labs, Fishers, IN) pomocí standardního spojovacího protokolu EDC. Tyto kuličky byly inkubovány s produktem SSG, fluorescenční randomizovanou DNA (bez sekvenční podobnosti s aptamerem) a chemicky syntetizovaným fluorescenčním aptamerem stejné sekvence. Jako negativní kontrolu jsme také inkubovali nepotažené kuličky s chemicky syntetizovaným fluorescenčním aptamérem. Inkubace probíhaly po dobu 30 minut a poté byly kuličky třikrát promyty. Na těchto částicích byla provedena průtoková cytometrie pomocí přístroje FACScalibur (BD Bioscience San Jose, CA). Bylo zaznamenáno rozložení intenzity fluorescence při excitaci světlem o vlnové délce 488 nm.

Generace a čištění jednoho řetězce (horizontální gelová elektroforéza)

Denaturační polyakrylamidový gel o koncentraci 7 M močoviny byl odlit horizontálně, jak bylo popsáno dříve (16). Stručně řečeno, 25 ml roztoku prepolymeru (7M močovina, 6% akrylamid/bis-akrylamid, SB pufr) bylo zahájeno 84 μl APS a 20 μl TEMED. Gelový prepolymer byl nalit do horizontální formy. Forma byla poté umístěna do plastového sáčku, který byl profouknut dusíkem. Gel se nechal polymerovat po dobu 30 min. Fluoresceinem značená a akriditem značená DNA byla smíchána v 1 M fosforečnanu sodném o pH 8,0 a žíhána zvýšením teploty na 80 °C a pomalým ochlazováním rychlostí 0,1 °C za sekundu na RT. Směs byla ochlazována pomalu, aby se podpořila mezimolekulární hybridizace mezi dvěma vlákny. Směs prepolymerů (2,5 ml) byla iniciována přidáním 8,4 μl APS a 2 μl TEMED. Po smíchání bylo 20 μl tohoto roztoku přidáno k 5 μl roztoku DNA. Ten byl poté přenesen do suché jamky v polyakrylamidovém gelu. Aby nedošlo k narušení linií elektrického pole, byly zbývající jamky naplněny akrylamidem neobsahujícím DNA. Naplněný gel byl vložen do plastového sáčku a profouknut dusíkem. Gel byl provozován při 10 V/cm po dobu 10 minut. Poté byl zobrazen pomocí modrého LED transiluminátoru a digitální kamery. Za účelem uvolnění ssDNA ze zesíťovaného gelu v jamce bylo 25 ml SB pufru zahřáto v mikrovlnné troubě k varu. Tento horký pufr byl poté nalit na gel. Elektroforéza pokračovala při 10 V/cm po dobu 10 minut. Pro porovnání byl gel opět zobrazen, jak je popsáno výše.

Počáteční spojení mezi fluoresceinem a akriditem značenou DNA bylo podpořeno použitím 1 M fosforečnanového pufru sodného. Pokud by DNA držela pohromadě pouze hybridizací, k uvolnění DNA do gelu by stačila 7 M močovina a výměna pufru do 5 mM SB pufru během elektroforézy. Místo toho bylo nutné použít teplo. To prokázalo, že pohyblivé vlákno DNA je spíše spojeno nebo zapleteno s gelem než se svým komplementárním vláknem DNA.

Výsledky a diskuse

Akriditem modifikovaná DNA je při elektroforéze nepohyblivá

Ze dvou vláken produktu dsDNA PCR je akriditové vlákno zachyceno v kopolymeru, zatímco komplementární vlákno je pohyblivé. Pro demonstraci této skutečnosti byla provedena PCR s jedním primerem modifikovaným jak akriditem, tak červeným fluorescenčním barvivem (Cy5). Reverzní primer byl modifikován fluoresceinem. Produkt PCR byl polymerizován do denaturujícího PAGE gelu (5 %). Schéma postupu je uvedeno na obrázku 1. Zpočátku jsou zelené fluorescenční i červené fluorescenční vlákno kolokalizovány (žlutě zbarvený gel). Po aplikaci napětí migruje do gelu pouze fluoresceinem značený produkt (zeleně). Akriditové a Cy5 společně značené vlákno (červené) je fixováno v konečném obrazu gelu (obrázek 1B). Zbytkový primer z reakce PCR je navíc jasně viditelný jako druhý zelený pás. Po elektroforéze lze čistý jednovláknový produkt rozříznout a eluovat podle standardních protokolů pro čištění gelu.

Ověření jednovláknové DNA

Oddělili jsme jednovláknovou, fluoresceinem modifikovanou DNA rozříznutím a elucí pásu zájmu. Abychom prokázali, že produkt získaný touto metodou je jednořetězcový, použili jsme dvě různé metody. První metodou byla analýza nativního gelu. Obrázek 2A ukazuje obrázek nativního gelu obsahujícího primer, produkt PCR (dsDNA) a ssDNA přečištěnou touto metodou. Nativní gel ukazuje jasné oddělení dsDNA a ssDNA. Po SSG s akriditovým primerem (s následným rozříznutím gelu a elucí produktu) je většina izolované DNA jednovláknová.

Tento výsledek jsme potvrdili pomocí hybridizační sondy modifikované zhášečem (obr. 2B). Sonda byla navržena tak, aby se zhášeč dostal do blízkosti fluoresceinové části na produktu ssDNA. Při hybridizaci snižuje molekula zhášeče intenzitu fluorescence o ∼90 %. Jelikož sonda hybridizuje pouze na ssDNA, tento experiment prokazuje, že fluoresceinem modifikovaný produkt byl jednovláknový. Jako negativní kontrolu jsme testovali také produkt dsDNA PCR. Dvouřetězcový produkt PCR nebyl schopen hybridizovat s quencherovou sondou, proto jeho fluorescence zůstala prakticky nezměněna.

Aptamery syntetizované pomocí PCR purifikované kopolymerizací a elektroforézou

Vysoce čistá ssDNA je produkována naší technikou SSG. Produkty ssDNA aptamerů z PCR jsme purifikovali dvěma metodami: (i) SSG kopolymerizací a elektroforézou a (ii) technikou imobilizace biotinu a avidinu popsanou jinde (tj. v Technickém listu 753 společnosti Polysciences) (17,18). Jednovláknové aptamery byly rovněž generovány chemickou syntézou. Obrázek 3A ukazuje ssDNA aptamery generované třemi různými metodami. V pruhu 1 je značkovací žebřík pro porovnání velikosti. Pruh 2 ukazuje purifikovanou ssDNA generovanou pomocí PCR s akriditovým primerem, po které následovala kopolymerizace s akrylamidem, elektroforéza a purifikace v gelu. Je vidět pouze jeden pás o správné velikosti pro ssDNA. Pruh 3 je ssDNA vytvořená PCR s biotinylovaným primerem a následným přečištěním pomocí magnetických kuliček potažených avidinem. Pruh 4 je chemicky syntetizovaná DNA se stejnou sekvencí. Purifikovaný ssDNA aptamer ze SSG pomocí kopolymerizace a elektroforézy prokázal vysokou čistotu ssDNA.

Dále jsme se snažili otestovat, zda tento postup vytváří funkční aptamery. Za tímto účelem jsme pomocí PCR s upravenými primery vytvořili dříve popsaný aptamér proti lysozymu. Aptamer proti lyzozymu „Clone 1“ byl poprvé vyroben v Ellingtonově laboratoři a původně byl vybrán jako RNA aptamer (19); jiné skupiny uvedly, že sekvence DNA také funguje jako aptamer (20,21). Zjistili jsme, že při PCR i chemické syntéze DNA vznikl funkční aptamer. Na základě těchto a dalších experimentů jsme dospěli k závěru, že se jedná o jeden z mála výjimečných případů, kdy RNA i její mateřská sekvence DNA vážou cíl. Jedná se o zvláštní a náhodný výsledek; většina aptamérů nefunguje, pokud jsou přeloženy přímo na jinou chemickou látku. Tyto výsledky potvrzují mnoho případů v literatuře, které naznačují, že aptamer klonu 1 proti lyzozymu je zvláštním případem.

Analýza průtokové cytometrie také ukázala, že SSG-purifikovaný ssDNA aptamer je funkční. Obrázek 4B ukazuje kuličky potažené lysozymem vystavené náhodné DNA, chemicky syntetizovanému aptameru proti lysozymu nebo našemu SSG-purifikovanému aptameru proti lysozymu. Jak SSG-purifikovaný, tak chemicky syntetizovaný aptamér vykazovaly silnou vazbu na kuličky potažené lysozymem, zatímco náhodná DNA nevykazovala žádnou významnou vazbu na kuličky s lysozymem. To naznačuje, že tyto interakce jsou specifické pro sekvenci aptaméru. Nepotažené kuličky nevykazují žádnou fluorescenci s aptamérem ani bez něj, což naznačuje, že vazba je specifická pro bílkovinu.

Zahřátím se uvolnila DNA z jamek

Při čištění ssDNA aptamérů z produktu PCR pomocí metody SSG bylo nutné gel zahřát, aby se usnadnila elektroforéza DNA (viz „Materiály a metody“). Abychom pochopili, proč to bylo nutné, použili jsme horizontální PAGE. Bez použití tepla se požadovaný produkt ssDNA PCR udržel v jamce, a to i přes použití 7 M močoviny a gradientu napětí.

Naší první hypotézou bylo, že toto udržení bylo způsobeno 80 bp hybridizace v produktu PCR. Abychom tuto teorii ověřili, snížili jsme komplementaritu na 23 bp annealováním fluoresceinem značené DNA aptameru klonu 1 (na obrázku 4 označeného jako F-Aptamer) na 23 nukleotidů dlouhý akriditem modifikovaný primer (na obrázku 4 označený jako AC-Clone1-P2) a provedli SSG kopolymerací a elektroforézou. Navzdory relativně krátké hybridizaci o délce 23 bp se v jamce zachovalo značné množství DNA aptameru (Obrázek 4A, spodní pruh). To naznačuje, že naše hypotéza byla nesprávná, protože kratší hybridizační úsek 23 bp, který by měl být snadno denaturován v 7 M močovině, neumožnil uvolnění požadovaného vlákna ssDNA z jamky.

Dále jsme testovali hypotézu, že retence závisí na délce. Zde jsme žíhali 5′-akriditem modifikovaný 19 nukleotidů dlouhý oligonukleotid (na obrázku 4 označený AC-DNA) na 19 nukleotidů dlouhý plně komplementární, fluoresceinem značený oligonukleotid (na obrázku 4 označený F-DNA*). Navzdory podobné délce hybridizace byla krátká DNA snadno přečištěna od svého komplementu v denaturačním gelu bez použití tepla. Do gelu se dostalo prakticky celé 19nukleotidové, fluoresceinem značené mobilní vlákno (obrázek 4A, prostřední pruh). Aby se ukázalo, že 19-mer modifikovaný akriditem byl zachován, bylo do jamky ko-polymerováno také vlákno modifikované fluoresceinem i akriditem (na obrázku 4 označené AC-DNA-F) (horní pruh), které bylo úspěšně zachováno. (podrobnosti o sekvenci a nomenklatuře viz „Materiály a metody“ a doplňková tabulka S1)

Po prvních 20 minutách elektroforézy (bez zahřívání) bylo zřejmé, že velká část DNA aptameru klonu 1 není pohyblivá (navzdory krátké hybridizační délce). Aby se aptamerová DNA uvolnila z polyakrylamidu, bylo nutné gel zahřát. V mikrovlnné troubě jsme zahřáli provozní pufr téměř k varu a pak jsme jej nalili na gel v oblasti jamek. Elektroforéza pak pokračovala dalších 20 minut (obrázek 4B, spodní pruh) a pás aptaméru se stal pohyblivým. Tento nový pás měl stejnou pohyblivost jako původní pohyblivý pás, což naznačuje, že se jedná o stejný druh aptameru. Stejně tak se jednalo o stejný vzorek DNA, který na obrázku 3A poskytl pouze jeden pás. Tento pokus dokazuje nutnost zahřátí gelu, aby se z polyakrylamidu uvolnila celá dlouhá ssDNA. Zadržení DNA v jamce není způsobeno hybridizací, ale pravděpodobně zapletením v polyakrylamidové matrici.

Horizontální PAGE pro generování jednoho řetězce a integrovanou elektroeluci

Použití horizontálního gelu umožňuje provést elektroeluci namísto řezání a extrakce pásu produktu. Použití druhého extrakčního hřebenu pro další jamky pro elektroeluci a extrakci v horizontální PAGE urychlilo SSG a elektroeluci DNA. Pomocí softwaru Inkscape jsme navrhli samostatný hřeben pro elektroeluci, který byl hlubší a širší než nakládací hřeben (šablona použitá k vyřezání hřebenů je uvedena v doplňkovém materiálu). Návrh byl vyřezán laserem z akrylu pomocí laserové řezačky CO2 (viz obrázek 5, A a B).

Typicky se PAGE provádí pomocí vertikálního gelu mezi skleněnými deskami. Pro odlití horizontálního gelu PAGE bylo nutné vyloučit kyslík během polymerace. Polymeraci jsme prováděli v sáčku naplněném plynným dusíkem (nebo argonem), abychom vyloučili kyslík. Gel byl odlit pomocí dvou hřebenů a elektroforéza byla provedena podle standardních postupů horizontální gelové elektroforézy.

Obrázek 5C ukazuje horizontální gel pro SSG pomocí kopolymerizace a elektroforézy s elektroelucí. Dráhy 1-4 (shora) obsahují pool aptamérů. Pruh 5 byl ponechán prázdný, aby nedošlo k neúmyslné křížové kontaminaci; standard primeru v pruhu 6 byl přítomen, aby se odlišil nežádoucí pás. Bazén byl amplifikován pomocí akriditem modifikovaného primeru a fluoresceinem značeného primeru. Akriditem modifikované vlákno bylo ponecháno v jamce. Produkt značený fluoresceinem je jasně viditelný při modrém osvětlení LED. Nechali jsme primer protéct extrakčními jamkami a vyjít na druhé straně gelu (viz obrázek 5D). Poté bylo možné pozorovat pásy produktu blížící se k extrakčním jamkám pod modrým světlem transiluminátoru v reálném čase. Když pásy produktu vstoupily do jamek, byly odsáty pipetou. Tento proces trval přibližně 1 h. Precipitace a regenerace pak probíhala podle publikovaných protokolů pro výběr aptamérů. Tím odpadla nutnost samostatného kroku separace vláken nebo noční extrakce gelu.

Existuje několik metod izolace ssDNA z dsDNA. Mezi metody purifikace ssDNA z produktů PCR patří: indukovaný pohybový posun (22), imobilizace biotin-avidinových kuliček (18), selektivní štěpení pomocí DNázy (23) a asymetrické přidání PCR primerů (24). Tyto metody se liší cenou, čistotou a škálovatelností. Indukovaný pohybový posun (22) v jednom primeru může způsobit problémy při amplifikaci (např. primery modifikované PEG mohou v PCR fungovat hůře) a enzymatické štěpení DNázou (23) nebo chemické přerušení jednoho vlákna zanechá nečistoty (a také zavede další krok do celého procesu). Asymetrické přidání primerů PCR (24) zanechá v produktu značné množství dsDNA a je velmi náchylné k chybám amplifikace. Nejoblíbenější metodou je extrakce nežádoucího, biotinylovaného vlákna pomocí mikrosfér potažených avidinem (18). Tato metoda má několik úskalí. Nereagovaný primer obsadí avidinová místa na kuličkách a interakce biotin-avidin se při teplotě tání dlouhé dvouřetězcové DNA rozpadne (25). To přispívá ke značnému znečištění dsDNA. Metody založené na kuličkách mají značné náklady: USD/nMol za avidinové kuličky plus 0,50 USD/nMol za biotinový primer. SSG pomocí kopolymerizace a elektroforézy vyžaduje pouze akriditový primer, který stojí 0,80 USD/nMol. Polyakrylamid je velmi levný a škálovatelný. Elektroforetická pohyblivost je druhým rozměrem purifikace, který je této technice vlastní. Z reakce PCR se v jediném kroku odstraní jak akriditem modifikované vlákno, tak případný zbytkový primer.

Ukázali jsme, že SSG lze použít k purifikaci funkčního aptameru. Tuto techniku lze také použít k purifikaci poolu ssDNA v průběhu selekce DNA aptamérů. Kromě toho může SSG najít uplatnění také při generování ssDNA pro afinitní sondy nebo páteře pro DNA origami (3). Je důležité poznamenat, že ve srovnání s chemickou syntézou má výroba DNA pomocí PCR mnohem vyšší sekvenční věrnost, což je zásadní pro aplikace, jako jsou výpočty DNA/obvody DNA (26).

.