Tandemová hmotnostní spektrometrie

Fragmentace iontů v plynné fázi je pro tandemovou hmotnostní spektrometrii nezbytná a probíhá mezi jednotlivými fázemi hmotnostní analýzy. K fragmentaci iontů se používá mnoho metod, které mohou vést k různým typům fragmentace, a tím k různým informacím o struktuře a složení molekuly.

Fragmentace ve zdrojiEdit

Často je proces ionizace dostatečně prudký, aby výsledné ionty měly dostatečnou vnitřní energii k fragmentaci v hmotnostním spektrometru. Pokud produktové ionty přetrvávají v nerovnovážném stavu po mírně dlouhou dobu před autodisociací, nazývá se tento proces metastabilní fragmentace. Nozzle-skimmer fragmentací se rozumí záměrné vyvolání fragmentace ve zdroji zvýšením potenciálu trysky-skimmeru u přístrojů obvykle založených na elektrospreji. Ačkoli fragmentace ve zdroji umožňuje fragmentační analýzu, nejedná se technicky o tandemovou hmotnostní spektrometrii, pokud nejsou před autodisociací hmotnostně analyzovány nebo vybrány metastabilní ionty a na vzniklých fragmentech není provedena druhá fáze analýzy. Fragmentaci ve zdroji lze použít namísto tandemové hmotnostní spektrometrie díky využití technologie Enhanced in-Source Fragmentation Annotation (EISA), která generuje fragmentaci přímo odpovídající datům tandemové hmotnostní spektrometrie. Fragmenty pozorované pomocí EISA mají vyšší intenzitu signálu než tradiční fragmenty, u nichž dochází ke ztrátám v kolizních celách tandemových hmotnostních spektrometrů. EISA umožňuje získávat fragmentační data na hmotnostních analyzátorech MS1, jako jsou přístroje s časem letu a přístroje s jedním kvadrupólem. In-source fragmentace se často používá jako doplněk k tandemové hmotnostní spektrometrii (s post-source fragmentací), aby bylo možné provést dva kroky fragmentace v experimentu typu pseudo MS3.

Kolizí indukovaná disociaceEdit

Post-source fragmentace je to, co se nejčastěji používá v experimentu tandemové hmotnostní spektrometrie. Energii lze iontům, které jsou obvykle již vibračně excitovány, přidat také prostřednictvím srážek po zdroji s neutrálními atomy nebo molekulami, absorpcí záření nebo přenosem či záchytem elektronu vícenásobně nabitým iontem. Srážkou indukovaná disociace (CID), nazývaná také srážkou aktivovaná disociace (CAD), zahrnuje srážku iontu s neutrálním atomem nebo molekulou v plynné fázi a následnou disociaci iontu. Uvažujme například

AB + + M ⟶ A + B + + M {\displaystyle {\ce {{AB+}+ M -> {A}+ {B+}+ M}}}}

kde se iont AB+ srazí s neutrálním druhem M a následně se rozpadne. Podrobnosti tohoto procesu popisuje srážková teorie. Vzhledem k rozdílné konfiguraci přístrojů jsou možné dva hlavní odlišné typy CID: (i) paprskový typ (při kterém jsou prekurzorové ionty fragmentovány za letu) a (ii) typ iontové pasti (při kterém jsou prekurzorové ionty nejprve zachyceny a poté fragmentovány).

Třetím a novějším typem fragmentace CID je kolizní disociace s vyšší energií (HCD). HCD je technika CID specifická pro hmotnostní spektrometry s orbitrapem, při níž fragmentace probíhá vně iontové pasti, děje se v cele HCD (v některých přístrojích pojmenované „iontový směrovací multipól“). HCD je fragmentace typu pasti, u které bylo prokázáno, že má vlastnosti svazku. Existují volně dostupné rozsáhlé databáze tandemové hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením (např. METLIN s 850 000 molekulárními standardy, každý s experimentálními daty CID MS/MS), které se obvykle používají k usnadnění identifikace malých molekul.

Metody záchytu a přenosu elektronůEdit

Energie uvolněná při přenosu elektronu na vícenásobně nabitý ion nebo při jeho záchytu může vyvolat fragmentaci.

Disociace při záchytu elektronůEdit

Přidá-li se elektron k vícenásobně nabitému kladnému iontu, uvolní se Coulombova energie. Přidání volného elektronu se nazývá disociace zachycením elektronu (ECD) a je reprezentováno vztahem

n + + e – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ ⟶ fragmenty {\displaystyle ^{n+}+{\ce {e^{-}->}}\levice^{(n-1)+}\pravice]^{*}{\ce {->fragments}}}

pro vícenásobně protonovanou molekulu M.

Disociace s přenosem elektronůEdit

Přidání elektronu prostřednictvím iontové reakce se nazývá disociace s přenosem elektronů (ETD). Podobně jako disociace zachycením elektronů vyvolává ETD fragmentaci kationtů (např. peptidů nebo proteinů) tím, že na ně přenáší elektrony. Vynalezli ji Donald F. Hunt, Joshua Coon, John E. P. Syka a Jarrod Marto na University of Virginia.

ETD nevyužívá volné elektrony, ale využívá k tomuto účelu radikálové anionty (např. antracen nebo azobenzen):

n + + A – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ + A ⟶ fragmenty {\displaystyle ^{n+}+{\ce {A^{-}->}}}levá^{(n-1)+}\pravá]^{*}+{\ce {A->fragments}}}

kde A je aniont.

ETD štěpí náhodně podél páteře peptidu (ionty c a z), zatímco postranní řetězce a modifikace, jako je fosforylace, zůstávají nedotčeny. Tato technika funguje dobře pouze pro ionty s vyšším nábojem (z>2), avšak ve srovnání s disociací vyvolanou srážkou (CID) je ETD výhodná pro fragmentaci delších peptidů nebo dokonce celých proteinů. Díky tomu je tato technika důležitá pro proteomiku shora dolů. Stejně jako ECD je ETD účinná pro peptidy s modifikacemi, jako je fosforylace.

Elektronový přenos a kolizní disociace s vyšší energií (EThcD) je kombinací ETD a HCD, kdy je peptidový prekurzor nejprve podroben iontové/iontové reakci s fluoranthenovými anionty v lineární iontové pasti, která generuje c- a z-ionty. Ve druhém kroku se na všechny ionty odvozené z ETD aplikuje HCD fragmentace všech iontů za účelem generování b- a y-iontů před konečnou analýzou v orbitrapovém analyzátoru. Tato metoda využívá duální fragmentaci ke generování iontově bohatých, a tedy datově bohatých MS/MS spekter pro sekvenování peptidů a lokalizaci PTM.

Záporná disociace s přenosem elektronůEdit

Fragmentace může probíhat také s deprotonovaným druhem, při níž je elektron přenesen z druhu na kationtové činidlo v záporné disociaci s přenosem elektronů (NETD):

n – + A + ⟶ ( n + 1 ) – ] ∗ + A ⟶ fragmenty {\displaystyle ^{n-}+{\ce {A+->}}\left^{(n+1)-}\right]^{*}+{\ce {A->fragments}}}

Po tomto přenosu projde aniont s nedostatkem elektronů vnitřním přeskupením a fragmentuje se. NETD je iontová/iontová obdoba disociace s odtržením elektronů (EDD).

NETD je slučitelná s fragmentací peptidů a proteinů podél páteře na vazbě Cα-C.

NETD je slučitelná s fragmentací peptidů a proteinů podél páteře na vazbě Cα-C. Výsledné fragmenty jsou obvykle produktové ionty typu a– a x.

Disociace s odtržením elektronůEdit

Disociace s odtržením elektronů (EDD) je metoda pro fragmentaci aniontových druhů v hmotnostní spektrometrii. Slouží jako negativní protirežim k disociaci s elektronovým záchytem. Záporně nabité ionty se aktivují ozářením elektrony o střední kinetické energii. Výsledkem je vyražení elektronů z mateřské iontové molekuly, což způsobí disociaci prostřednictvím rekombinace.

Disociace s přenosem nábojeEdit

Reakce mezi kladně nabitými peptidy a kationtovými činidly, známá také jako disociace s přenosem náboje (CTD), byla nedávno prokázána jako alternativní vysokoenergetická cesta fragmentace pro peptidy v nízkém stavu náboje (1+ nebo 2+). Navrhovaný mechanismus CTD s použitím kationtů helia jako činidla je:

1 + + He + ⟶ 2 + ] ∗ + He 0 ⟶ fragmenty {\displaystyle {\ce {{^{1}+}+He+->}}\left^{2}+}}\right]^{*}+{\ce {He^{0}->fragments}}}

Počáteční zprávy uvádějí, že CTD způsobuje štěpení páteřní vazby Cα-C peptidů a poskytuje produktové ionty typu a– a x.

FotodisociaceEdit

Energii potřebnou k disociaci lze přidat absorpcí fotonů, což vede k fotodisociaci iontů a je reprezentováno vztahem

AB + + h ν ⟶ A + B + {\displaystyle {\ce {{AB+}+{\mathit {h\nu }}->{A}+B+}}}.

kde h ν {\displaystyle h\nu }

představuje foton absorbovaný iontem. Lze použít ultrafialové lasery, které však mohou vést k nadměrné fragmentaci biomolekul.

Infračervená multifotonová disociaceUpravit

Infračervené fotony zahřejí ionty a způsobí disociaci, pokud je jich absorbováno dostatečné množství. Tento proces se nazývá infračervená multifotonová disociace (IRMPD) a často se provádí pomocí laseru na bázi oxidu uhličitého a hmotnostního spektrometru s iontovou pastí, jako je FTMS.

Infračervená zářivá disociace černého tělesaEdit

Záření černého tělesa lze použít k fotodisociaci v technice známé jako infračervená zářivá disociace černého tělesa (BIRD). Při metodě BIRD se celá vakuová komora hmotnostního spektrometru zahřívá, čímž vzniká infračervené světlo. BIRD využívá toto záření k excitaci stále energetičtějších vibrací iontů, dokud nedojde k přerušení vazby a vzniku fragmentů. To je podobné infračervené multifotonové disociaci, která také využívá infračervené světlo, ale z jiného zdroje. BIRD se nejčastěji používá s hmotnostní spektrometrií s iontovou cyklotronovou rezonancí s Fourierovou transformací.

Disociace vyvolaná povrchemEdit

Při disociaci vyvolané povrchem (SID) je fragmentace výsledkem srážky iontu s povrchem ve vysokém vakuu. SID se dnes používá k fragmentaci široké škály iontů. Před lety se SID běžně používala pouze na jednonásobně nabité druhy s nižší hmotností, protože ionizační metody a technologie hmotnostních analyzátorů nebyly dostatečně pokročilé, aby mohly správně tvořit, přenášet nebo charakterizovat ionty s vysokou m/z. Postupem času se jako kolizní povrchy pro SID v tandemovém spektrometru nejčastěji používaly samouspořádané monovrstvy (SAM) složené z CF3(CF2)10CH2CH2S na zlatě. SAM fungují jako nejžádanější kolizní cíle díky svým charakteristicky velkým efektivním hmotnostem pro srážky přicházejících iontů. Navíc jsou tyto povrchy tvořeny tuhými fluorouhlíkovými řetězci, které výrazně netlumí energii vrhaných iontů. Fluorouhlíkové řetězce jsou výhodné také díky své schopnosti odolávat snadnému přenosu elektronů z povrchu kovu na přicházející ionty. Schopnost SID vytvářet subkomplexy, které zůstávají stabilní a poskytují cenné informace o konektivitě, je nesrovnatelná s žádnou jinou disociační technikou. Vzhledem k tomu, že komplexy vzniklé při SID jsou stabilní a zachovávají si rozložení náboje na fragmentu, vzniká jedinečné spektrum, v němž se komplex soustřeďuje kolem užšího rozdělení m/z. Produkty SID a energie, při které vznikají, odrážejí sílu a topologii komplexu. Unikátní disociační vzorce pomáhají odhalit kvartérní strukturu komplexu. Symetrické rozložení náboje a disociační závislost jsou pro SID jedinečné a díky nim se vytvořená spektra liší od všech ostatních disociačních technik.

Technika SID je použitelná také v hmotnostní spektrometrii iontové pohyblivosti (IM-MS). Tři různé metody této techniky zahrnují analýzu charakterizace topologie, mezipodjednotkové konektivity a stupně rozbalení pro strukturu proteinu. Analýza rozkládání proteinové struktury je nejčastěji používanou aplikací techniky SID. Pro hmotnostní spektrometrii s iontovou pohyblivostí (IM-MS) se SID používá k disociaci zdrojových aktivovaných prekurzorů tří různých typů proteinových komplexů: C-reaktivního proteinu (CRP), transtyretinu (TTR) a konkanavalinu A (Con A). Tato metoda se používá k pozorování stupně rozkladu pro každý z těchto komplexů. Pro toto pozorování SID ukázal struktury prekurzorových iontů, které existují před srážkou s povrchem. IM-MS využívá SID jako přímé měření konformace pro každou podjednotku proteinů.

Fourierova iontová cyklotronová rezonance (FTICR) je schopna poskytnout ultravysoké rozlišení a vysokou hmotnostní přesnost přístrojům, které provádějí měření hmotnosti. Díky těmto vlastnostem jsou hmotnostní spektrometry FTICR užitečným nástrojem pro širokou škálu aplikací, jako je několik disociačních experimentů, například disociace indukovaná srážkou (CID), disociace s přenosem elektronů (ETD) a další. Kromě toho byla na tomto přístroji implementována povrchově indukovaná disociace pro studium základní fragmentace peptidů. Konkrétně byla SID použita ke studiu energetiky a kinetiky fragmentace v plynné fázi v rámci přístroje ICR. Tento přístup byl použit k pochopení fragmentace protonovaných peptidů v plynné fázi, peptidových iontů s lichými elektrony, nekovalentních komplexů ligand-peptid a ligovaných kovových klastrů v plynné fázi

.