Terapeutický význam 1,4-dihydropyridinových sloučenin jako potenciálních protinádorových látek

Úvod

Snadná a účinná syntéza biologicky aktivních molekul je jedním z hlavních cílů organické a medicinální chemie. V posledních letech se vícesložkové reakce staly jedním z důležitých nástrojů při syntéze strukturně rozmanitých chemických knihoven polyfunkčních organických molekul podobných léčivům . MCR navíc nabízejí výhodu jednoduchosti a syntetické účinnosti oproti konvenčním chemickým reakcím v několika aspektech. MCR umožňují konstrukci kombinatorických knihoven složitých organických molekul pro účinnou identifikaci a optimalizaci vedoucí struktury při objevování léčiv .

V pokračování naší probíhající výzkumné práce na mikrovlnami asistované syntéze nanomateriálů jsme zjistili, že nanokrystalické oxidy kovů přitahují značnou pozornost syntetických a medicinálních chemiků díky své vysoké katalytické aktivitě a možnosti opakovaného použití . Oxid zinečnatý je levný, stabilní vůči vlhkosti, opakovaně použitelný, komerčně dostupný a netoxický, nerozpustný v polárních i nepolárních rozpouštědlech . Široká škála organických reakcí, které zahrnují Beckmannovy přestavby , N-benzylaci , acylaci , dehydrataci oximů , reakce otevírání nukleofilních kruhů epoxidů , syntézu cyklické močoviny , N-formylaci aminů . Zejména krystalický oxid nano-ZnO vykazuje lepší katalytickou aktivitu ve srovnání se svými protějšky o objemové velikosti .

V posledních letech se velká pozornost věnuje syntéze dihydropyridinových sloučenin vzhledem k jejich obrovskému využití v různých oblastech výzkumu včetně biologických věd a lékařské chemie . Mnohé DHP jsou již komerčními produkty, jako například: amlodipin, felodipin, isradipin, lacidipin, nikardipin, nitrendipin, nifedipin a nimodipin B, z nichž nitrendipin a nemadipin B vykazují silnou aktivitu blokování vápníkových kanálů (obr. 1) a staly se jednou z nejdůležitějších tříd léčiv pro léčbu kardiovaskulárních onemocnění . Kromě toho mají dihydropyridinové deriváty řadu biologických aktivit, jako jsou geroprotektivní, hepatoprotektivní, antiaterosklerotické, protinádorové a antidiabetické aktivity . Rozsáhlé studie odhalily, že sloučeniny obsahující dihydropyridinové jednotky vykazují různé léčebné funkce, jako je neuroprotektivum, antiagregační aktivita krevních destiček, mozková antiischemická aktivita při léčbě Alzheimerovy choroby, chemosenzitizér při léčbě nádorů . Modifikátory lékové rezistence , antioxidanty a léčivo pro léčbu močové inkontinence .

S cílem modelovat a pochopit tyto biologické vlastnosti a vyvinout nová chemoterapeutika založená na sloučeninách 1,4-DHP bylo věnováno značné úsilí vytvoření účinných metod jejich syntézy. Obecně byly 1,4-DHP syntetizovány Hantzschovou metodou , která zahrnuje cyklokondenzaci aldehydu, β-ketoesteru a amoniaku buď v kyselině octové, nebo pod refluxem v alkoholech po dlouhou dobu reakce, což obvykle vede k nízkým výtěžkům. Další metody zahrnují použití mikrovln , vysokých teplot při refluxu , organokatalyzátorů a kovových triflátů .

V poslední době je DNA důležitým cílem léčiv a reguluje mnoho biochemických procesů, které probíhají v buněčném systému. Interakce malých molekul s DNA jsou nadále intenzivně a široce studovány pro jejich užitečnost jako sondy buněčné replikace a regulace transkripce a pro jejich potenciál jako léčiv . Zejména navrhování sloučenin na základě jejich schopnosti štěpit DNA má velký význam nejen z primárně biologického hlediska, ale také z hlediska fotodynamického terapeutického přístupu k vývoji účinných léčiv . Deriváty 1,4-dihydropyridinu přitahují pozornost chemiků díky svým rozmanitým biologickým aplikacím . Biologický význam této třídy sloučenin nás podnítil k rozšíření této řady prací na syntéze a studiu fotokleavace DNA 1,4-dihydropyridinových derivátů. V tomto sdělení byla uvedena syntéza 1,4-dihydropyridinových derivátů a studie jejich fotokleavage na DNA a molekulární dokování.

V literatuře je známo několik metod syntézy 1,4-dihydropyridinových derivátů. V pokračování našeho programu zaměřeného na chemii nanomateriálů zde uvádíme účinnou mikrovlnnou metodu pro syntézu krystalických ZnO-NPs. ZnO použitý v této práci byl syntetizován podle modifikované metody. Připravené krystalické ZnO-nano-částice byly charakterizovány pomocí práškové XRD, SEM a EDX (obr. 2). Náš syntetický postup začal kondenzací 1 ekv. benzaldehydu 1a s 2 ekv. ethylacetoacetátu 2a a 2 ekv. NH4OAc 3a v přítomnosti ZnO-Nps za vzniku Hantzschova 1,4-dihydropyridinu 4a (obr. 3). Reakce byla dokončena za 5 min pod mikrovlnným zářením a produkt byl izolován obvyklým zpracováním v 90% výtěžku a vysoké čistotě. Za podobných podmínek reagovaly různé substituované aromatické aldehydy nesoucí buď elektron-donující, nebo -odtahující substituenty s 1,3-diketony za vzniku 1,4-DHP v dobrých až vynikajících výtěžcích a výsledky jsou shrnuty v tabulce 1.

Postup s asistencí mikrovlnného záření velmi často minimalizuje vznik vedlejších produktů a vyžaduje mnohem méně času než tepelné metody. Hlavními výhodami provádění reakcí za kontrolovaných podmínek v uzavřených nádobách jsou výrazné zvýšení rychlosti a vyšší výtěžky produktů, kterých lze často dosáhnout. Proto jsme se v návaznosti na naše studie mikrovlnné syntézy nanomateriálů pokusili vyvinout rychlý, mikrovlnami asistovaný protokol pro syntézu 1,4-DHP s použitím krystalického ZnO-nano katalyzátoru (obr. 3).

Štěpení DNA derivátů 1,4-DHP bylo studováno pomocí elektroforézy v agarosovém gelu. Při elektroforéze kruhové plazmidové DNA byla pozorována relativně rychlá migrace neporušené superzávitové DNA (typ I). Pokud dojde ke štěpení na jednom vlákně (nicking), superzávitová DNA se uvolní a vytvoří pomaleji se pohybující otevřenou kruhovou formu (typ II). Pokud dojde ke štěpení obou vláken, vznikne lineární forma (typ III), která migruje mezi typy I a II . Přeměna typu I (supercoiled) na typ II (nicked circular) byla pozorována s různou koncentrací 1,4-DHP a ozařována po dobu 2 h, v poměru 1:9 DMSO/trisbuffer (20 μM, pH- 7,2) při 365 nm. U kontroly, v níž 1,4-DHP nebyl přítomen (pruh 1), nebylo pozorováno žádné štěpení DNA (obrázek 4). Se zvyšující se koncentrací těchto 1,4-DHP se množství DNA typu I z pUC 19 postupně snižovalo, zatímco množství typu II se zvyšovalo (Obrázek 4).

Při koncentraci 40 μM může sloučenina (4c) podporovat pouze 30% přeměnu DNA z typu I na II (Obrázek 5). Při koncentraci 80 μM může sloučenina (4c) téměř podpořit asi 80% konverzi DNA z typu I na II (obrázek 5). Štěpný potenciál testovaných sloučenin byl hodnocen porovnáním pásů, které se objevily u kontrolních a testovaných sloučenin při koncentraci 80 μM. Ostatní deriváty však vykazují mnohem nižší štěpnou účinnost pro DNA pUC 19. Dokonce i při koncentraci 80 μM mohou podpořit pouze 40% konverzi DNA z typu I na II (obr. 5).

Při vyšších koncentracích kolem 130 μM se však sloučeniny vysráží a v DNA není žádný moment. Obrázek (Obrázek 6) jasně ukazuje, že sloučeniny (4b, 4c, 4d, 4e, 4f a 4g) vykazují štěpení DNA pUC19 DNA při koncentraci 80 μM. Výsledky ukázaly, že sloučeniny nesoucí -OCH3 a -OH v poloze -para fenylového kruhu (C-6) štěpí DNA úplně, ostatní sloučeniny vykazují téměř úplné štěpení DNA. Celkově to naznačuje, že alkoxy skupiny jsou vysoce reaktivní radikály, které účinně abstrahují atomy vodíku na C-4′ 2-deoxyribózy. Je zajímavé poznamenat, že hydroxylová skupina údajně způsobuje poškození DNA zprostředkované kyslíkovými radikály v přítomnosti fotozáření .

Studie vztahu struktury a aktivity 1,4-DHP s ohledem na studium fotokleavace DNA ukazují, že změny v substitučním schématu v polohách C-3, C-4 a C-5 mění kruh 1,4-DHP. Osiris Property Explorer je jedním z takových nástrojů pro predikci aktivity založených na znalostech, který předpovídá podobnost léčiv, skóre léčiv a nežádoucí vlastnosti, jako jsou mutagenní, tumorigenní, dráždivé a reprodukční účinky nových sloučenin, na základě údajů o chemických fragmentech dostupných léčiv a neléčiv, jak je uvedeno (tabulka 2) . Bylo zjištěno, že sloučeniny s alifatickými skupinami, jako jsou -CH3, -COOCH3, -COOC2H5 a -COOC(CH3)3, připojenými k C-2 a C-3 1,4-DHP vykazují dobrou aktivitu. Další deriváty s elektron-donujícími substituenty, jako jsou hydroxy a methoxy skupina na fenylovém kruhu (C-6), zvyšují fotokleavagační aktivitu DNA. Osamělý pár elektronů na atomu kyslíku methoxy skupiny se delokalizuje do π prostoru benzenového kruhu, čímž zvyšuje aktivitu. Podobně elektron-odtahující substituent, jako je 4-fluorofenyl, 4-chlorfenyl 1,4-DHP, aktivitu snižuje. Tyto výsledky naznačují, že za štěpení DNA jsou odpovědné alkoxy substituenty a dusík pyridinového kruhu ve struktuře 1,4-DHP.

S cílem racionalizovat pozorované spektroskopické výsledky a získat více informací o způsobu interkalace byly 1,4-DHP (4a-r) postupně dokovány v rámci DNA duplexu sekvence d(CGCGAATTCGCG)2 dodekameru (PDB ID: 1BNA) s cílem předpovědět vybrané vazebné místo spolu s preferovanou orientací ligandu uvnitř minoritní drážky DNA. Všechny syntetizované deriváty 1,4-DHP byly nakresleny v programu ChemSketch a struktury byly uloženy ve formátu .mol. Poté byl formát .mol použit v programu Hyperchem-7 k úpravě jejich fragmentů, následovala minimalizace celkové energie ligandů tak, aby mohly dosáhnout stabilní konformace, a soubor byl uložen ve formátu .pdb.

Proteinová 3D struktura B-DNA byla získána z RCSB PDB (informační portál k biologickým makromolekulárním strukturám). Ze souboru byly odstraněny molekuly vody a protein byl ve 3D protonován, aby se přidaly polární vodíky. Vazebná kapsa byla identifikována pomocí nástroje site finder a byla vybrána příslušná rezidua. Parametry dokování byly nastaveny na výchozí hodnoty a skórovací algoritmus, při dokování bylo zachováno 30 konformací pro každý ligand. Dokované struktury proteinů byly uloženy ve formátu .pdb a konformace ligandů byly zkoumány jedna po druhé. Komplexy s nejlepšími konformacemi byly vybrány na základě nejvyššího skóre, nejnižší vazebné energie a minimálních hodnot RMSD .

Syntetizované organické sloučeniny vykonávají svou biologickou aktivitu účinněji tím, že vážou příslušný protein nebo DNA v jejich specifickém vazebném místě. Identifikace interagujících zbytků s ligandy je nezbytným krokem k racionálnímu návrhu léčiv, pochopení molekulární dráhy a mechanistického působení proteinu.

Molekulární dokování bylo provedeno mezi rigidním receptorovým proteinem a flexibilními ligandy. Tabulka 3 uvádí podrobnosti výsledků dokování včetně hodnot RMSD a vazebné energie komplexů protein-ligand. Ligandy (4b, 4c, 4 h, 4i, 4n a 4o) se silně vážou na B-DNA, jak vyplývá z jejich minimálních hodnot vazebné energie, tj. -13,8, -12,9 a -12,3 kcal/mol (Obrázek 7).

Obrázek 8 ukazuje polohu aktivního místa ve šroubovicové struktuře DNA a také ukazuje, že všechny dokované ligandy se shlukovaly uvnitř kapsy. Na obrázku 8 je znázorněna interakce vodíkových vazeb 4c a 4d s klíčovými zbytky v aktivním místě uvnitř šroubovicové struktury DNA. V tomto modelu je jasně naznačeno, že sloučenina 4c vytvořila vodíkovou vazbu mezi -OH a N1 thyminu, což jsou DT7 a DT19 s délkou vazby 2,02, resp. 2,05 Ǻ. Ostatní deriváty 1,4-DHP navíc tvořily s DNA méně interakcí H-vazby v důsledku orientace aromatického kruhu zapojeného do van der Waalsových interakcí (model Wireframe) a plochých hydrofobních oblastí vazebných míst DNA (tab. 3). Tyto výsledky prokázaly, že molekulární dokovací studie in silico 1,4-DHP s B-DNA naznačují, že 1,4-DHP má potenciál narušovat hydrofobní a H-vazbové interakce, čímž ovlivňuje stabilitu vazby B-DNA, a může být účinný pro nádorové buněčné linie.

.