Klíčové enzymy a komponentyEdit
Proces V(D)J rekombinace je zprostředkován VDJ rekombinázou, což je rozmanitý soubor enzymů. Klíčovými enzymy, které se na ní podílejí, jsou rekombinační aktivační geny 1 a 2 (RAG), terminální deoxynukleotidyltransferáza (TdT) a nukleáza Artemis, člen všudypřítomné cesty nehomologního spojování konců (NHEJ) pro opravy DNA. Je známo několik dalších enzymů, které se na tomto procesu podílejí a mezi něž patří DNA-dependentní protein kináza (DNA-PK), XRCC4 (X-ray repair cross-complementing protein 4), DNA ligáza IV, NHEJ1 (non-homologous end-joining factor 1; známý také jako Cernunnos nebo XRCC4-like factor ), nedávno objevený paralog XRCC4 a XLF (PAXX) a DNA polymerázy λ a μ. Některé zapojené enzymy jsou specifické pro lymfocyty (např. RAG, TdT), zatímco jiné se vyskytují v jiných typech buněk a dokonce všudypřítomně (např. komponenty NHEJ).
Pro zachování specifičnosti rekombinace rekombináza V(D)J rozpoznává a váže se na rekombinační signální sekvence (RSS) lemující variabilní (V), diverzitní (D) a spojovací (J) genové segmenty. RSS se skládají ze tří prvků: heptameru o sedmi konzervovaných nukleotidech, spacerové oblasti o délce 12 nebo 23 párů bází a nonameru o devíti konzervovaných nukleotidech. Ačkoli se většina RSS liší v sekvenci, konsenzuální sekvence heptameru a nonameru jsou CACAGTG a ACAAAAACC; a ačkoli sekvence distanční oblasti je málo konzervovaná, její délka je vysoce konzervovaná. Délka spacerové oblasti odpovídá přibližně jednomu (12 párů bází) nebo dvěma závitům (23 párů bází) šroubovice DNA. Podle takzvaného pravidla 12/23 obvykle sousedí genové segmenty určené k rekombinaci s RSS o různých délkách spaceru (tj. jeden má „12RSS“ a druhý „23RSS“). To je důležitý rys v regulaci rekombinace V(D)J.
ProcessEdit
Rekombinace V(D)J začíná, když se rekombináza V(D)J (prostřednictvím aktivity RAG1) naváže na RSS lemující kódující genový segment (V, D nebo J) a vytvoří jednořetězcový zářez v DNA mezi první bází RSS (těsně před heptamerem) a kódujícím segmentem. To je v podstatě energeticky neutrální (není nutná hydrolýza ATP) a vede k vytvoření volné 3′ hydroxylové skupiny a 5′ fosfátové skupiny na stejném vlákně. Reaktivní hydroxylová skupina je rekombinázou umístěna tak, aby napadla fosfodiesterovou vazbu opačného vlákna a vytvořila dva konce DNA: vlásenku (stem-loop) na kódujícím segmentu a tupý konec na signálním segmentu. Podle současného modelu dochází ke zkracování DNA a tvorbě vlásenek na obou vláknech současně (nebo téměř současně) v komplexu známém jako rekombinační centrum.
Tupé signální konce jsou spláchnuty dohromady a vytvářejí kruhový kus DNA obsahující všechny intervenující sekvence mezi kódujícími segmenty známý jako signální spoj (ačkoli je kruhový, nelze jej zaměňovat s plazmidem). Ačkoli se původně předpokládalo, že se ztratí během následných buněčných dělení, existují důkazy, že signální spoje mohou znovu vstoupit do genomu a vést k patologickým stavům aktivací onkogenů nebo přerušením funkce nádorových supresorových genů.
Kódující konce jsou před jejich spojením dále zpracovávány několika událostmi, které nakonec vedou k junkční diverzitě. Zpracování začíná, když se DNA-PK naváže na každý přerušený konec DNA a rekrutuje několik dalších proteinů včetně Artemis, XRCC4, DNA ligázy IV, Cernunnos a několika DNA polymeráz. DNA-PK vytvoří komplex, který vede k její autofosforylaci, což má za následek aktivaci Artemis. Aktivitou Artemis dochází k otevření kódujících koncových vlásenek. Pokud se otevřou uprostřed, vznikne tupý konec DNA; v mnoha případech však dojde k otevření „mimo střed“ a výsledkem je, že na jednom vlákně zůstanou báze navíc (převis). Ty jsou známé jako palindromické (P) nukleotidy kvůli palindromické povaze sekvence, která vznikne, když enzymy opravující DNA vyřeší převis. Proces otevření vlásenky pomocí Artemis je klíčovým krokem V(D)J rekombinace a je defektní u myšího modelu těžké kombinované imunodeficience (scid).
Následující kroky XRCC4, Cernunnos a DNA-PK zarovnávají konce DNA a rekrutují terminální deoxynukleotidyltransferázu (TdT), DNA polymerázu nezávislou na šabloně, která přidává netemplované (N) nukleotidy na kódující konec. Přidávání je většinou náhodné, ale TdT dává přednost G/C nukleotidům. Stejně jako všechny známé polymerázy DNA přidává TdT nukleotidy do jednoho vlákna ve směru od 5′ ke 3′.
Nakonec exonukleázy mohou z kódujících konců odstraňovat báze (včetně případných P nebo N nukleotidů). Polymerázy DNA λ a μ pak podle potřeby vloží další nukleotidy, aby byly oba konce kompatibilní pro spojení. Jedná se o stochastický proces, proto může nastat jakákoli kombinace přidávání nukleotidů P a N a exonukleolytického odstraňování (nebo také žádná). Nakonec jsou zpracované kódující konce spojeny ligázou DNA IV.
Všechny tyto procesy zpracování vedou k paratopu, který je velmi variabilní, i když jsou rekombinovány stejné genové segmenty. V(D)J rekombinace umožňuje tvorbu imunoglobulinů a T buněčných receptorů na antigeny, se kterými se organismus ani jeho předek (předkové) nemuseli dříve setkat, což umožňuje adaptivní imunitní odpověď na nové patogeny, které se objeví, nebo na ty, které se často mění (např. sezónní chřipka). Hlavní výhradou tohoto procesu však je, že sekvence DNA musí zůstat v rámci, aby byla zachována správná sekvence aminokyselin v konečném bílkovinném produktu. Pokud je výsledná sekvence mimo rámec, vývoj buňky se zastaví a buňka nepřežije do dospělosti. V(D)J rekombinace je proto velmi nákladný proces, který musí být (a je) přísně regulován a kontrolován.