Na GroEL se může vázat jak denaturovaný, tak nativní BR
Ústředním prvkem mechanismu aktivity GroEL je jeho schopnost rozpoznávat různorodé polypeptidy, a to především prostřednictvím interakcí mezi hydrofobními zbytky substrátu a šroubovicemi H a I na apikálních doménách GroEL (obr. 1A) (Coyle et al. 1997). Zde byla nejprve zkoumána vazba denaturovaného i nativního BR na GroEL pomocí izotermické titrační kalorimetrie (ITC), protože každý stav má hojné hydrofobní povrchové zbytky, které jsou pro GroEL snadno přístupné. Jak ukazuje obr. 2A, titrace GroEL s BR poskytuje v obou případech exotermické titrační termogramy. Tepelné změny jsou způsobeny specificky vazbou BR na GroEL, protože postupné vstřikování BR do testovacích pufrů bez chaperoninu dává ploché termogramy (doplňkový obr. S1). Teplo každé injekce uvedené na obr. 2A bylo integrováno, korigováno o ředicí teplo a vyneseno do grafu v závislosti na molárním poměru BR: GroEL (obr. 2B). Změna tepla odpovídá jedné sadě vazebného modelu míst (červená a modrá křivka) a dává disociační konstantu (Kd) blízkou 0,3 nmol/l pro denaturovanou BR, resp. blízkou 6,0 nmol/l pro nativní BR (tab. 1). Denaturace BR tedy zvýšila vazebnou afinitu GroEL k tomuto membránovému proteinu o jeden řád. Na druhé straně je vazba obou vzorků BR řízena příznivou změnou entalpie (ΔH) a proti ní stojí záporná změna entropie (ΔS); vazebná stechiometrie (N) stanovená v obou případech se blíží jednotce (tab. 1). Vazba nativního BR je však zjevně méně entalpická s menší kompenzací entropie.
Vazba BR na GroEL posuzovaná pomocí ITC. A Titrace GroEL s BR denaturovaným SDS (dBR, červeně) nebo nativním BR (nBR. modře). Termogramy byly zaznamenány při 20 °C pomocí přístroje MicroCal ITC200. B Tepelná výměna každého nástřiku v bodě A byla integrována a vynesena do grafu v závislosti na molárním poměru BR:GroEL. Plné čáry představují přizpůsobení dat modelu s jednou sadou míst (všechna místa jsou identická a ekvivalentní) a získané termodynamické parametry jsou uvedeny v tabulce 1
Ko-chaperonin GroES ve tvaru víčka je nezbytnou součástí při skládání proteinů zprostředkovaném GroEL u bakterií, a bylo prokázáno, že sdílí stejná vazebná místa na GroEL se substrátem (Chen a Sigler 1999). Titrace GroEL s denaturovaným BR v přítomnosti GroES ukazuje, že GroES má na vazbu BR malý vliv (doplňkový obr. S2 a tab. 1). Tento výsledek lze pochopit s ohledem na Kd, které bylo pro tvorbu komplexu GroEL/ES dříve stanoveno na 3 μmol/l a je výrazně vyšší než zde stanovené Kd komplexu BR-GroEL (Behlke et al. 1997). To naznačuje mnohem slabší interakci obou chaperoninových proteinů, a tudíž odpovídá nevýznamnému účinku. V přítomnosti ATP, který reguluje cykly vazby a uvolňování GroEL a GroES in vivo, by se však afinita GroEL/ES zvýšila o tři řády (normálně Kd ~1 nmol/L) (Farr et al. 2000), což by teoreticky mohlo konkurovat vazbě BR na GroEL. Následně byl zkoumán vliv apoGroEL na skládání BR a poté role GroES a ATP v tomto procesu.
Systém GroEL-GroES může modulovat skládání BR v přítomnosti DDM
Bylo pozorováno, že část BR denaturovaného SDS se znovu skládá, když se zředí přebytkem rozpouštěcího detergentu n-dodecyl-β-D-maltosidu (DDM), jak bylo zjištěno měřením obnovení absorpce sítnice (doplňkový obr. S3) (Booth 1997). V testovacím pufru bez detergentu nebo doplněném samotným GroEL nebylo zjištěno žádné významné zotavení. V přítomnosti DDM však přídavek GroEL vykazoval zřejmý vliv na skládání BR (doplňkový obr. S3). Rychlostní konstanta pro skládání zprostředkované GroEL (0,15 μmol/l), jak bylo vyhodnoceno fitováním pomocí jednoduché exponenciální kinetiky, byla odhadnuta jako ~dvakrát nižší než spontánní skládání. Je známo, že GroEL obvykle zpomaluje skládání rozpustných proteinů, které se mohou účinně skládat v jeho nepřítomnosti. To bylo vysvětleno soutěží mezi intramolekulárním skládáním a mezimolekulární vazbou na GroEL (Gray a Fersht 1993; Itzhaki et al. 1995). Zdá se zcela pravděpodobné, že GroEL se chová podobně při opětovném skládání denaturovaného BR. Když byla koncentrace GroEL zvýšena na 0,30 μmol/l, odhadovaná rychlostní konstanta se zjevně nezměnila, zatímco výtěžek skládání dosáhl po 60 min mnohem vyšší úrovně než spontánní skládání (doplňkový obr. S3). Tato data ukazují, že apoGroEL může snížit rychlost skládání BR, ale zvýšit výtěžek složeného proteinu.
Protože bakteriální buňky obsahují několik milimolárů ATP a za normálních podmínek je relativní molární poměr GroES versus GroEL 1,9 a po tepelném šoku 4,7 (Moparthi et al. 2013); GroEL pravděpodobně nezůstane dlouho bez vazby ATP a GroES. V přítomnosti ATP (modrá barva na obr. 3A) bylo obnovení správně složeného BR výrazně rychlejší a větší ve srovnání se samotným apoGroEL nebo spontánním procesem (červená a černá barva na obr. 3A). Naproti tomu kombinace GroEL a GroES vykazovala jen malý vliv na rychlost spontánního skládání, ale do určité míry snižovala výtěžek (obr. 3A, modrá barva). To naznačuje interakci mezi GroEL a GroES bez požadavku na ATP, pravděpodobně vyvolanou BR navázaným na GroEL, což mělo naopak nepříznivý vliv na obnovu správně složeného proteinu. Při použití kompletního chaperoninového systému (obr. 3A, zelená) bylo pozorováno maximální zvýšení rychlosti, ale výtěžnost skládání se pohybovala mezi oběma předchozími případy.
Časový průběh skládání BR modulovaný systémem GroEL-GroES závislým na ATP. A Obnova složeného BR byla průběžně sledována pomocí absorbance při 554 nm. Byly provedeny následující přídavky: žádný (černá); 0,3 μmol/l GroEL (červená); 0,3 μmol/l GroEL a 5 mmol/l ATP (modrá); 0,3 μmol/l GroEL a 0,6 μmol/l GroES (azurová); 0,3 μmol/l GroEL, 0,6 μmol/l GroES a 5 mmol/l ATP (zelená). B Nejprve bylo provedeno čisté skládání BR zprostředkované GroEL; poté byl vzorek v T = 60 min doplněn pouze ATP, pouze GroES nebo oběma, jak je uvedeno. C Pro srovnání s A byl analyzován také vliv necyklické jednookruhové (SR1) verze GroEL na skládání BR. Použité koncentrace SR1, GroES a ATP byly 0,6 μmol/l, 1,2 μmol/l a 5 mmol/l v uvedeném pořadí. D Vliv GroEL/ES plus ATP na nativní skládání BR byl zkoumán sledováním změny absorbance při 560 nm. Koncentrace chaperoninu a nukleotidu použité v B a D byly stejné jako v A. BR byla ve všech experimentech udržována na hodnotě 2,4 μmol/l. Modrá a zelená čára v A a modrá čára v C představují přizpůsobení dat třífázové exponenciální rovnici, zatímco zbývající čáry představují přizpůsobení pomocí jednoduché exponenciální rovnice. Všechny čáry v B a D jsou jednoduchými vodítky pro oka
Výše uvedené výsledky naznačují, že ATP a GroES mohou ovlivňovat skládání BR zprostředkované GroEL různým způsobem. Vazba GroES na GroEL je pro skládání poněkud škodlivá, na rozdíl od známé pozitivní role zapouzdření substrátu v kleci GroEL/ES pro asistované skládání (Jewett a Shea 2010). Dále jsme si položili otázku, jak tento nepříznivý účinek vzniká. Zajímavé je, že samotný GroES nebo jeho sekvence pohyblivé smyčky, přes kterou se GroES váže na GroEL, také usnadňovaly obnovu složeného BR (doplňkový obr. S4). Smyčková sekvence navíc vykazovala podobný účinek jako GroES při skládání zprostředkovaném GroEL v nepřítomnosti a přítomnosti ATP (doplňkový obr. S4). Ačkoli nemůže vytvořit uzavřenou čepičku nad centrální dutinou GroEL jako GroES, což naznačuje významný příspěvek interakce smyčka-GroEL ke skládání. Pozoruhodné je, že hydrofobní zbytky na apikálním povrchu GroEL, které se podílejí na vazbě pohyblivé smyčky GroES, se většinou překrývají s těmi, které se podílejí na vazbě substrátového proteinu (Motojima et al. 2000). Je nepravděpodobné, že by hydrofobní BR byl mobilní smyčkou vytlačen a uvolněn do hydrofilní klece GroEL/ES, zejména vzhledem k přítomnosti DDM micel vně klece, které by dále podporovaly skládání nebo solubilizaci BR. S výhodou, jak bylo prokázáno u asistovaného skládání několika rozpustných proteinů (Motojima a Yoshida 2010), může být BR zachycena v blízkosti rozhraní GroEL/ES a částečně vyčnívat ven, když byl v této studii použit celý systém nebo dokonce jen GroEL/ES. Taková interakce může bránit BR v přístupu k výhodným DDM micelám, což vede ke sníženému výtěžku skládání pozorovanému jak u GroES, tak u jeho mobilní smyčky.
Některé studie však naznačují, že úlohou ATP a GroES je pouze disociovat lepivé substráty (tj. s Kd v oblasti nmol/l stanovené zde), které omezují rychlost asistovaného skládání nebo dokonce inhibují skládací aktivitu GroEL, pokud nejsou odstraněny (Priya et al. 2013). Abychom otestovali, zda GroES a ATP vykazují podobný účinek při asistovaném skládání BR, inkubovali jsme nejprve apoGroEL s denaturovaným BR po dobu 60 min; poté jsme přidali GroEL a/nebo ATP (obr. 3B). Následné přidání jedné z obou složek dále podpořilo skládání BR, ale bylo méně účinné než současné přidání obou, což ukazuje na synergismus mezi oběma složkami při napomáhání skládání zprostředkovanému GroEL. Měření anizotropie s transmembránovými peptidy BR, které byly použity jako mimetika denaturovaného BR, aby se obešly komplikace způsobené dynamickou povahou denaturovaného BR a interakcí GroEL-BR, ukázala, že pouze kombinace ATP a GroES byla schopna účinně oddělit předformovaný komplex peptid-GroEL (doplňkový obr. S5). Zdá se tedy, že jak GroES, tak ATP jsou nezbytné k disociaci vysoce afinitních konformerů BR a regeneraci zastavených vazebných (nebo katalytických) míst GroEL.
Pro další zkoumání vlivu GroES a ATP na skládání BR zprostředkované GroEL jsme použili jednokroužkový mutant GroEL (SR1), který tvoří stabilní komplex s GroES (Weissman et al. 1995), na rozdíl od cyklického systému GroEL-GroES. Podobně jako při našem pozorování s GroEL zvýšil ATP rychlost a výtěžek skládání zprostředkovaného SR1 (modrá barva na obr. 3C), zatímco přítomnost GroES oba aspekty výrazně snížila (azurová barva) ve srovnání s případem se samotným apoSR1 nebo spontánním procesem (červená nebo černá barva). Vzhledem k tomu, že pomocí ITC bylo zjištěno, že denaturovaný BR se váže na SR1 se stechiometrií blízkou jednotce (doplňkový obr. S2), a použitá SR1 byla dvakrát koncentrovanější než GroEL, předpokládáme, že se vytvořilo více komplexů BR-SR1 než BR-GroEL, přičemž GroES měl větší vliv na skládání (azurová). Podle očekávání mělo přidání ATP i GroES nevýznamný vliv na obnovu BR (zelená), což lze přičíst nevratné vazbě GroES na SR1 v přítomnosti ATP (Weissman et al. 1995). Tento výsledek navíc naznačuje, že maximální zvýšení rychlosti pozorované u GroEL je způsobeno ATP regulovanými vícenásobnými cykly vazby a uvolňování GroES.
GroEL samotný nebo v kombinaci s ATP a/nebo GroES vykazoval zanedbatelný vliv na strukturu nativního BR solubilizovaného pomocí DDM (obr. 3D), což ukazuje na silnější intramolekulární interakci uvnitř nativního proteinu než na mezimolekulární vazbu na GroEL. Chaperoninem zprostředkovaný přechod BR z metastabilního denaturovaného stavu do nativního stavu je tedy termodynamicky příznivý.
Důkaz pro chaperoninem zprostředkovanou disagregaci i unfolding
Měření spontánního skládání BR při různých koncentracích ukazuje, že agregace vedla pouze k částečnému obnovení správně složeného BR a zdánlivá rychlost byla nezávislá na koncentraci, což znamená, že agregace byla nevratná (doplňkový obr. S6). V nepřítomnosti solubilizujícího detergentu DDM byl pomocí fluorescenční korelační spektroskopie (FCS) odhadnut difuzní koeficient (~67 μm2/s) BR denaturované SDS mnohem nižší než BR vázané na GroEL (~104 μm2/s) (obr. 4). To odráží skutečnost, že agregáty tvořené denaturovaným BR jsou ještě větší než komplex BR-GroEL s vazebnou stechiometrií blízkou jednotce, jak bylo stanoveno pomocí ITC. To také znamená, že GroEL dokázal narušit agregační strukturu, čímž v podstatě přečerpal produktivní cestu skládání s monomerním BR. Navíc bylo zjištěno, že nBR solubilizovaný s DDM má difuzní koeficient ~117 μm2/s, což je více než u dBR s GroEL a mnohem více než u samotného dBR (obr. 4). To naznačuje, že nBR byl v přítomnosti DDM dobře dispergován, a také podporuje myšlenku disagregace dBR zprostředkované GroEL. Kromě toho, když byl do denaturovaného BR přidán kompletní chaperoninový systém, byly okamžitě patrné bílé flokující precipitáty (údaje nejsou uvedeny), což svědčí o vynuceném rozbalování a také o synergismu mezi GroES a ATP v tomto ohledu. Bez rozpouštěcích detergentů nebo lipidů, které napodobují biologické membrány v objemovém roztoku, by se nesložený BR okamžitě shlukoval a srážel, na rozdíl od výrazného zvýšení rychlosti skládání pozorovaného v přítomnosti DDM.
FCS měření denaturovaného BR v nepřítomnosti nebo přítomnosti GroEL ve srovnání s nativním BR. Fluorescenční autokorelační amplitudy G(τ) fluorescence Alexa Fluor 488 byly zobrazeny pro samotnou BR denaturovanou SDS nebo s přebytkem GroEL v nepřítomnosti solubilizujícího detergentu nebo nativní BR solubilizovanou DDM. Difuzní koeficienty (D) byly získány fitováním auto-korelační křivky pomocí rovnice 1. Směrodatné odchylky byly ze tří nezávislých měření
Membránová inzerce BR zprostředkovaná GroEL-GroES
Pro zjištění, zda nebo jak by GroEL-GroES podporoval integraci BR do dvojvrstvy, byly připraveny invertované cytoplazmatické membránové vezikuly (IMV) z Escherichia. coli a smíchány s denaturovaným BR v přítomnosti a nepřítomnosti apoGroEL nebo plus ATP/GroES (obr. 5A). ApoGroEL způsobil nevýznamnou změnu v obnově správně složeného BR v IMV, měřeno pomocí UV-Vis spektroskopie (černá a červená barva). Na rozdíl od opětovného skládání v DDM micelách se ukázalo, že přídavek GroEL a ATP škodí vkládání do membrány (modrá), zatímco GroEL v kombinaci s GroES tento proces usnadňuje (azurová). Skutečný důvod tohoto reprodukovatelného rozdílu není znám, ale možným důvodem by mohla být rigidita IMV a strukturní změna BR vázané na GroEL vyvolaná vazbou ATP nebo GroES. Konkrétně je známo, že vazba ATP na GroEL způsobuje rozšíření otvoru do dutiny chaperoninu (Skjaerven et al. 2015). Tato změna je výraznější než změna způsobená pouhou vazbou GroES na GroEL (Kim et al. 2005), čímž pravděpodobně umožňuje rozbalení navázaného substrátu (Lin et al. 2008; Sharma et al. 2008), příznivé pro produktivní skládání ve vhodném rozpouštědle. Na rozdíl od DDM micel, které jsou vysoce dynamické, však IMVs pravděpodobně nebyly schopny pohotově ochránit rozložený druh BR a včas poskytnout výhodné mikroprostředí pro skládání. Oproti tomu slabá asociace GroES s GroEL v nepřítomnosti ATP by mohla dodávat BR do připravených IMVs účinnějším způsobem. Podobně jako při opětovném skládání v DDM micelách však kompletní systém GroEL-GroES výrazně zlepšil membránové vkládání BR (zeleně), které rychle dosáhlo ustáleného stavu, přičemž množství obnoveného BR se pohybovalo mezi oběma předchozími případy.
Vkládání BR do IMV zprostředkované systémem GroEL-GroES. A Vkládání a/nebo opětovné skládání denaturovaného BR (2,4 μmol/l) do IMV bylo průběžně sledováno pomocí absorbance při 554 nm. Byly provedeny následující přídavky: žádný (černá); 0,3 μmol/l GroEL (červená); 0,3 μmol/l GroEL a 5 mmol/l ATP (modrá); 0,3 μmol/l GroEL a 0,6 μmol/l GroES (azurová); 0,3 μmol/l GroEL, 0,6 μmol/l GroES a 5 mmol/l ATP (zelená). B Nativní BR lze účinně přenášet na IMV v přítomnosti GroEL s pomocí ATP a GroES. Testované koncentrace nativního BR, GroEL, GroES a ATP byly 0,4, 5, 10 μmol/L, resp. 5 mmol/L
Dále byla použita fluorescenční anizotropie ke zkoumání vlivu bakteriálních chaperoninů na vkládání BR do IMV (obr. 5B). Když byl fluorescenčně značený nativní BR smíchán s nadměrným množstvím GroEL, anizotropie se posunula na vyšší hodnotu, což dokazuje, že membránový protein vytvořil stabilní komplex s chaperoninem. Důležité je, že následné přidání IMV vedlo k dalšímu zvýšení anizotropie, což svědčí o integraci BR do IMV. Bylo zjištěno, že ATP a GroES dále zvyšují přenos BR do membrány, jak se soudí také podle zvýšení anizotropie. Tyto výsledky dávají předpoklad, že GroEL spolu s GroES a ATP mohou mít přímou úlohu při integraci proteinů do lipidové dvojvrstvy in vivo.
.