V této studii jsme zkoumali vliv akutní intravenózní objemové zátěže 0.9% fyziologického roztoku, 3% fyziologického roztoku a infuze izotonické glukózy na u-AQP2 a u-ENaCγ v randomizované, zkřížené studii zdravých osob. Cílem bylo zhodnotit transportní aktivitu prostřednictvím vodních kanálů aquaporinu 2 a epiteliálních sodíkových kanálů v hlavních buňkách v distální části nefronu.
Během infuze a v období bezprostředně po ní dochází k adaptačním fyziologickým změnám ve funkci ledvin a vazoaktivních hormonů. Lze tedy očekávat, že k hlavním změnám proměnných účinku dojde až po infuzi. V této studii jsme věnovali zvláštní pozornost změnám proměnných účinku v posledním období po infuzi (Post infusion 210-240), tj. 60-90 minut po ukončení infuze. V tomto období se u-AQP2 zvýšil po infuzi hypertonického a izotonického fyziologického roztoku a snížil po infuzi glukózy. Současně se u-ENaCγ zvýšil po infuzi hypertonického fyziologického roztoku a zůstal nezměněn po infuzi izotonického fyziologického roztoku a glukózy.
U-AQP2 po infuzi s hypotonickým a izotonickým fyziologickým roztokem a izotonickou glukózou
Aquaporin-2 (AQP2) se nachází v hlavních buňkách sběrného kanálku a je exprimován v apikální plazmatické membráně . Vazopresin (AVP) reguluje AQP2 vazbou na receptory V2 v bazolaterální membráně, . Krátkodobé působení AVP způsobuje přesun a zasunutí intracelulárních vezikul obsahujících AQP2 do apikální membrány a zvyšuje propustnost a absorpci vody . Dlouhodobá regulace probíhá po dobu hodin až dnů a je způsobena transkripcí genů regulovanou AVP, která vede ke zvýšení množství AQP2 v celých buňkách . Pokusy na potkanech ukázaly, že infuze dDAVP zvyšuje u-AQP2 . To je v souladu s názorem, že zvýšená dodávka kanálů AQP2 do apikální membrány vede ke zvýšenému vylučování AQP2 po stimulaci AVP . Přibližně 3 % AQP2 ve sběrném kanálku se vylučují do moči , ale základní mechanismy nejsou známy.
Rozšíření objemu 3% hypertonickým roztokem zvyšuje osmolaritu plazmy nad práh hypotalamických osmoreceptorů, což vyvolává uvolnění AVP a následné zvýšení u-AQP2. Saito et al zjistili významný vztah mezi vylučováním AQP2 močí a p-AVP u zdravých osob po infuzi 5% hypertonického roztoku . Pedersen et al zjistili pozitivní korelaci mezi u-AQP2 a p-AVP během 24hodinové deprivace vody a po infuzi 3% hypertonického roztoku . Předchozí studie u lidí tedy prokázaly, že aktivitu vodních kanálů AQP2 lze určit měřením u-AQP2 . Baumgartner et al překvapivě nezjistili žádnou změnu u-AQP2 po infuzi 2,5% NaCl u zdravých dobrovolníků, a to navzdory významnému zvýšení osmolarity moči i AVP . V porovnání s naší studií však byla perorální zátěž vodou před infuzí 3-4krát vyšší. Velká zátěž vodou před infuzí tedy mohla přehlušit stimulační účinky hypertonického fyziologického roztoku. Podle očekávání naše studie ukázala, že u-AQP2 se zvýšil po 3% NaCl s odpovídajícím zvýšením osmolarity moči a snížením CH2O. Naše zjištění tedy naznačují zvýšenou reabsorpci vody prostřednictvím vodních kanálů aquaporinu-2 v distálních tubulech. Před zvýšením u-AQP2 došlo k náhlému zvýšení p-osm a p-AVP vyvolanému infuzí hypertonického solného roztoku. Studie na zvířatech ukázaly, že hypertonicita může způsobit zvýšení exprese AQP2 v apikální membráně srovnatelné s expresí dosaženou samotným AVP . Nelze vyloučit, že to může hrát aktivní roli ve zvýšeném vylučování u-AQP2. S největší pravděpodobností byla zvýšená reabsorpce vody zprostředkována zvýšením p-AVP. U-AQP2 nadále stoupal po celý den vyšetření, což naznačuje, že kanály AQP2 zůstaly vloženy a aktivní v apikální membráně v důsledku působení zvýšeného p-AVP.
Infuze izotonického fyziologického roztoku snižuje frakční reabsorpci vody a soli v proximálních tubulech u zvířat . V této studii způsobila infuze 0,9% NaCl stejnou reakci u-AQP2, u-osm a CH2O jako infuze 3% NaCl, i když v menší míře. Došlo k malému vzestupu p-osm na maximální úroveň 286 mosmol/kg odpovídající vzestupu o 0,5 %. Toto zvýšení je pod prahem osmoreceptorů a nezaznamenali jsme ani neočekávali žádnou významnou změnu p-AVP. AVP tedy nemohl být hlavním regulátorem AQP2 během působení 0,9% NaCl. S největší pravděpodobností je zvýšený transport vody prostřednictvím AQP2 kompenzačním jevem, který má antagonizovat snížení absorpce vody ledvinami v proximálních tubulech, k němuž dochází po izotonické objemové expanzi. Mechanismus může být způsoben zvýšenou aktivitou v systému natriuretických peptidů .
Infuze 5% glukózy způsobuje objemovou expanzi rozloženou do všech fází tekutin v těle s jen velmi malým zvýšením objemu plazmy. To ilustruje měření plazmatického albuminu, jehož koncentrace ve 240. minutě se prakticky rovnaly výchozí hodnotě (tabulka 4), což svědčí o tom, že nedošlo k žádné změně extracelulární tekutiny. Podle našich znalostí žádná studie neměřila u-AQP2 po infuzi glukózy. Studie na zdravých subjektech ukázala, že po perorální zátěži vodou 20 ml/kg po dobu 15 minut (průměrný příjem 1605 ml) se u-AQP2 po 210 minutách snížil o 17 % . V nedávné studii subjekty dostaly perorální zátěž vodou 20 ml/kg po dobu 15 minut (průměrný příjem 1389 ml) s následným 27% poklesem u-AQP2 po 240 minutách . Snížila se jak osmolarita plazmy, tak p-AVP. Ukázalo se tedy, že během vodní diurézy po perorálním příjmu vody dochází ke snížení u-AQP2 .
V naší studii subjekty dostaly průměrně 1736 ml glukózy intravenózně. V posledním období po infuzi došlo k očekávané akvaretické reakci s 16% poklesem u-AQP2cr, poklesem u-osm a zvýšením UO a CH2O. Osmolarita plazmy se snížila z 285 mosm/kg na 280 m0sm/kg, tj. pokles o 2 %, avšak bez doprovodného snížení p-AVP. Naše zjištění naznačují sníženou reabsorpci vody prostřednictvím vodních kanálů akvaporinu-2 v distálních tubulech po infuzi izotonické glukózy. Absenci změny p-AVP lze vysvětlit jednak tím, že subjekty před zahájením infuze dostaly 1225 ml perorální zátěže vodou, což mohlo v předchozím období potlačit AVP ve výchozím období. Za druhé, měření koncentrace p-AVP nemusí být dostatečně citlivé, aby odhalilo malý pokles. Svou roli může hrát i nedávno objevený peptid apelin. Apelin je kolozalizován s AVP v magnocelulárních neuronech hypotalamu . U zdravých dobrovolníků mužského pohlaví snížení osmolarity plazmy pomocí zátěže vodou mírně snížilo p-AVP, ale p-Apelin se rychle zvýšil . Regulace apelinu je opačná než regulace AVP a údaje naznačují, že apelin se stejně jako AVP může podílet na regulaci homeostázy vody . Neměřili jsme p-Apelin, ale mohlo by být zajímavé zkoumat plazmatický apelin souběžně s p-AVP v podmínkách různých objemových expanzí.
V posledním období po infuzi se u-AQP2 zvýšil přibližně ve stejné míře po hypertonické a izotonické infuzi fyziologického roztoku, zatímco po izotonické infuzi glukózy byl pozorován výrazný pokles. Možné vysvětlení zpoždění změn u-AQP2 by mohlo spočívat v tom, že trvá několik minut, než změny AVP působí na hlavní buňku, ať už vložením nebo odstraněním AQP2 z apikální membrány, ale trvá několik minut, než se účinek projeví ve vylučování u-AQP2 v moči.
U-ENaCγ po infuzi s hypotonickým a izotonickým fyziologickým roztokem a izotonickou glukózou
Transport sodíku přes sběrný kanálek probíhá přes epiteliální sodíkový kanál a je zodpovědný za reabsorpci 3-5 % filtrovaného sodíku . ENaC se skládá ze tří různých podjednotek: α, β a γ a je lokalizován na apikální plazmatické membráně hlavních buněk . ENaC je cílem aldosteronu, který působí na mineralokortikoidní receptor. Aldosteron zvyšuje transport sodíku redistribucí podjednotek ENaC z intracelulárních míst na apikální membránu a také mění transkripci genů . Zatímco působení aldosteronu probíhá v průběhu hodin nebo dnů, další synergicky působící cesta zahrnuje AVP . V kortikálních sběrných kanálcích u potkanů se AVP váže na receptory V2, stimuluje cAMP a zvyšuje reabsorpci sodíku tím, že podporuje přenos a vložení ENaC do apikální membrány, což vyvolává rychlou změnu aktivity kanálů . Nedávné studie u lidí prokázaly, že AVP prostřednictvím receptorů V2 stimuluje reabsorpci sodíku zprostředkovanou ENaC přes hlavní buňky .
Frakce ENaC se normálně vylučují do moči. Předpokládá se, že množství frakcí ENaC odráží aktivitu transportu sodíku prostřednictvím epiteliálních sodíkových kanálů, stejně jako u-AQP2 odráží funkční stav vodních kanálů AQP2. Naše skupina nedávno zavedla novou metodu hodnocení reabsorpce sodíku v hlavních buňkách distálních tubulů. Lauridsen et al prokázali významnou korelaci mezi změnami vylučování sodíku močí a změnami vylučování beta frakce moče (u-ENaCβ) u zdravých lidí . U-ENaCβ lze zřejmě použít jako biomarker pro transport sodíku prostřednictvím ENaC. V této studii jsme měřili gama frakci proteinu epiteliálních sodíkových kanálů, abychom zhodnotili vzestupnou a sestupnou regulaci exprese γ-ENaC a transport sodíku prostřednictvím ENaC, jak již dříve uvedla naše skupina .
Symportér sodíku a chloridu (NCC) v distálních stočených tubulech (DCT) je jako další hlavní cesta reabsorpce sodíku. Reabsorpce sodíku v DCT je zásadní pro určení množství dodaného sodíku do hlavních buněk sběrného kanálku. Všeobecně se uznává, že NCC je regulována Ang II a aldosteronem . Studie také ukázaly, že vysoká hladina AVP zvyšuje fosforylaci NCC a pravděpodobně vede k větší reabsorpci sodíku .
Experimentální studie na zvířatech prokázaly, že izotonický a hypertonický fyziologický roztok IV snižuje reabsorpci sodíku v proximálních tubulech, a tím zvyšuje množství sodíku v moči . Andersen LJ a kol. studovali účinky hypertonického a izotonického fyziologického roztoku u zdravých osob na kontrolované dietě. Subjekty dostávaly intravenózně nálož sodíku buď 25 ml/kg izotonického roztoku, nebo 4,5 ml/kg 3% hypertonického roztoku po dobu 90 minut . Vylučování sodíku močí se zvýšilo jak při podání izotonického, tak hypertonického fyziologického roztoku, přičemž natriuréza po hypertonickém fyziologickém roztoku byla vyšší než po izotonickém fyziologickém roztoku. Plazmatický sodík a plazmatická osmolarita se po hypertonickém roztoku výrazně zvýšily, stejně jako p-AVP. Naše studie ukázala, že infuze 3% NaCl zvýšila u-ENaCγ, FENa, p-Osm, p-Na a p-AVP. Naše výsledky tedy odrážejí zvýšenou reabsorpci sodíku prostřednictvím ENaC v hlavních buňkách a navíc potvrzují výsledky Andersena et al . Zvýšený u-ENaCγ lze částečně vysvětlit výrazným snížením renální absorpce sodíku proximálně v nefronu, kompenzovaným a upraveným zvýšením absorpce v distální části. Vzestup p-AVP pozorovaný bezprostředně po infuzi 3% NaCl by však také mohl naznačovat, že zvýšení u-ENaCγ je způsobeno působením AVP. Zvýšený pohyb sodíku z lumen do buňky prostřednictvím ENaC by teoreticky vedl k sekreci draslíku přes kanály ROMK . Překvapivě jsme naměřili pokles vylučování draslíku močí. To by mohlo svědčit proti hlavní roli transportu sodíku zprostředkovaného ENaC. Pokud by NCC zvýšil reabsorpci sodíku, a to jak kvůli kompenzaci poklesu proximální reabsorpce, tak kvůli vysokému p-AVP, pak by se prostřednictvím ENaC transportovalo méně sodíku, a nedocházelo by tedy k vylučování draslíku. Možná role NCC po infuzi s hypertonickým fyziologickým roztokem je čistě spekulativní, protože jsme aktivitu NCC neměřili. Možná jsme v našich časových limitech nezaznamenali pozitivní vliv na sekreci draslíku. Transport draslíku je však komplexní a faktorů modulujících transport draslíku, jako je změněný tubulární průtok a aldosteron, je mnoho.
Po objemové expanzi izotonickým roztokem se mírně sníží onkotický tlak, což vede k okamžitému zvýšení GFR a menší reabsorpci vody v proximálním tubulu. Naměřili jsme malé zvýšení GFR a výdeje UO. Zvýšilo se vylučování sodíku, ale u-ENaCγ, p-Na, p-osm a p-AVP zůstaly beze změny, nálezy tedy odpovídaly našemu očekávání. Pokud jde o NCC, nelze očekávat žádnou změnu v reabsorpci sodíku zprostředkované NCC během izotonického roztoku.
Žádná studie nikdy nehodnotila u-ENaCγ během vodní diurézy. V naší studii jsme naměřili trend ke snížení u-ENaCγ po infuzi glukózy, což odráží malé snížení reabsorpce sodíku prostřednictvím ENaC v hlavní buňce. Jak již bylo zmíněno, naměřili jsme 2% pokles p-osmolality po infuzi glukózy, což by teoreticky mělo vyvolat pokles AVP. Pokles p-AVP jsme nezaznamenali, pravděpodobně kvůli nízkému p-AVP způsobenému předchozí perorální zátěží vodou nebo kvůli tomu, že měření koncentrace p-AVP nemusí být dostatečně citlivé k detekci malých změn. Lze předpokládat, že pokles u-ENaCγ by mohl být způsoben nedostatečnou vazbou AVP na receptory V2 v bazolaterální membráně hlavní buňky. Nedostatek podnětů AVP vede ke zvýšené endocytóze kanálů ENaC z povrchu membrány do recyklačních vezikul, čímž se snižuje reabsorpce sodíku .
V posledním období po infuzi se tedy u-ENaCγ výrazně zvýšil po infuzi hypertonického roztoku, po infuzi izotonického roztoku byl přibližně na stejné úrovni a v reakci na infuzi glukózy se snížil nebo měl tendenci se snižovat. Vzestup p-osm a p-AVP byl pozorován bezprostředně po ukončení infuze 3% NaCl. Zpoždění a konstantní hladinu u-ENaCγ po hypertonickém fyziologickém roztoku by bylo možné vysvětlit tím, že zvýšení transportu intracelulárních depotů kanálů ENaC do apikální membrány trvá několik minut, ale vylučování ENaC do moči po stimulaci AVP trvá několik minut.
Vazoaktivní hormony
Kromě AVP je klíčovým regulátorem vylučování sodíku ledvinami, a tím i objemu tělesných tekutin, systém renin-angiotenzin-aldosteron (RAAS). Je dobře známo, že deplece sodíku aktivuje a že chronická zátěž sodíkem snižuje RAAS . Studie in vitro a in vivo ukázaly, že aldosteron stimuluje mineralokortikoidní receptor ke zvýšené transkripci genů kódujících proteiny podílející se na transportu sodíku, tj. ENaC a Na,K-ATPázy .
Mnoho studií změn krevního objemu prokázalo, že akutní změny jsou spojeny s inverzní úpravou systému renin-angiotenzin-aldosteron . V této studii vedla expanze objemu 3% a 0,9% fyziologickým roztokem k podobnému a významnému snížení PRC, p-AngII a Aldo v souladu se zvýšením extracelulárního objemu. To je v souladu s předchozími studiemi .
Po infuzi glukózy jsme nenaměřili žádnou významnou změnu PRC, p-AngII ani p-Aldo. To bylo očekávané, protože infuze glukózy nezpůsobuje žádnou výraznou změnu extracelulárního objemu. Naše studie nebyla navržena tak, aby umožnila jakýkoli regulační účinek aldosteronu, protože k působení aldosteronu dochází v průběhu hodin nebo dnů. Na regulaci ENaC se proto musí podílet jiné faktory.
Silné stránky a omezení
Hlavní silnou stránkou této studie byl její design jako randomizované zkřížené studie s homogenní skupinou zdravých mladých mužů a žen. Podmínky testu byly velmi dobře definovány, pokud jde o stravu, příjem sodíku a tekutin. Výsledky tedy nejsou zkresleny rozdílnou solnou nebo vodní bilancí. Tato studie zkoumala pouze akutní účinky objemové expanze. Nepochybně bychom mohli získat další informace týkající se dlouhodobých účinků objemové expanze a vylučování AQP2 a ENaCγ močí, pokud by doba po infuzi byla delší. Studie navíc nebyla kontrolována placebem, a to infuzí zanedbatelného množství 0,9% fyziologického roztoku. To mohlo odlišit účinky objemové expanze od celkové variability reabsorpce vody a solí. V této studii nebylo možné provést měření ANP. To by mohlo pozitivně přispět k našim výsledkům.