Vliv perorálně podávaného vodního extraktu Atractylodes macrocephala Koidz na zánětlivou reakci makrofágů a T-buněk u myší

Abstrakt

Oddenek Atractylodes macrocephala Koidz (AM) je součástí různých receptů na posílení čchi. Hodnotili jsme zánětlivé reakce v makrofázích a T-buňkách izolovaných z myší po perorálním podání vodného extraktu AM (AME). Z myší, kterým byl podán thioglykolát, byly izolovány buňky peritoneálního exsudátu a byly zkoumány změny ve scavengerových receptorech. Peritoneální makrofágy byly stimulovány lipopolysacharidem (LPS). Byly rovněž hodnoceny odpovědi sérových cytokinů na intraperitoneální injekci LPS. Byly izolovány sleziny a měřeno jejich složení a funkční odpovědi. Obsah atraktylenolidu I a atraktylenolidu III, známých protizánětlivých složek, v AME byl 0,0338 mg/g extraktu a 0,565 mg/g extraktu. AME zvýšil počet SRA(+)CD11b(+) buněk v reakci na thioglykolát. Peritoneální makrofágy izolované ze skupiny s AME nevykazovaly žádné změny v zánětlivých markerech, jako je tumor nekrotizující faktor- (TNF-) α, interleukin- (IL-) 6, indukovatelná syntáza oxidu dusnatého a cyklooxygenáza-2, ale vykazovaly pokles exprese CD86. Je zajímavé, že AME snížil sérové hladiny TNF-α a IL-6 po intraperitoneální injekci LPS. Pokud jde o adaptivní imunitní systém, AME zvýšil populaci CD4(+) T buněk a expresi molekul hlavního histokompatibilního komplexu II. třídy ve slezině a kultivované splenocyty ze skupiny AME vykazovaly zvýšenou produkci IL-4 současně se sníženou produkcí interferonu-γ během aktivace T buněk. AME podporoval doplňování peritoneálních makrofágů během zánětlivé reakce, ale jeho protizánětlivá aktivita se nezdála být zprostředkována modulací aktivity makrofágů. AME také změnil imunitní stav CD4 T buněk, čímž podpořil Th2 odpověď.

1. Úvod

Zánět je ochranná reakce k eliminaci škodlivých podnětů a imunitní buňky jsou hlavními účastníky tohoto procesu. V závislosti na způsobu rozpoznání antigenu a schopnosti vytvářet paměťovou odpověď se imunitní buňky dělí na vrozený imunitní systém a adaptivní imunitní systém . Vrozené imunitní buňky, jako jsou makrofágy a dendritické buňky, reagují na antigen okamžitě s omezenou receptorovou specifičností . Adaptivní imunitní buňky, tvořené T-lymfocyty a B-lymfocyty, jsou antigenně specifické, zahajují odpověď na antigen, který se dostal do periferní lymfatické tkáně, a vytvářejí paměťovou odpověď . Vrozené imunitní buňky jsou hlavními aktéry v počátečních fázích zánětu, ale postupem času přebírají úlohu adaptivní imunitní buňky.

Makrofágy sídlící ve tkáních hrají klíčovou roli v imunitě a integritě tkání . Většina tkáňových makrofágů je odvozena z embryonálních prekurzorů . Za ustálených podmínek se jejich populace udržují díky své dlouhověkosti a lokální proliferaci a některé makrofágy jsou doplňovány buňkami pocházejícími z krevních monocytů . Během zánětu se na místo rekrutují monocyty odvozené z kostní dřeně a diferencují se v makrofágy . Makrofágy likvidují patogeny a antigeny fagocytózou a vyvolávají zánětlivé reakce produkcí cytokinů a enzymů, jako je tumor nekrotizující faktor α (TNF-), interleukin 6 (IL-), indukovatelná syntáza oxidu dusnatého (iNOS) a cyklooxygenáza 2 (COX-). Kromě toho jsou makrofágy jedním z typů profesionálních antigen prezentujících buněk (APC), které prezentují antigeny T buňkám .

T buňky, které se skládají hlavně z CD4 T buněk a CD8 T buněk, se aktivují, když se T buněčné receptory (TCR) dostanou do kontaktu s antigenními peptidy vázanými molekulami hlavního histokompatibilního komplexu (MHC) na APC . T buňky CD4, které tvoří více než dvě třetiny T buněk, se mohou diferencovat na různé efektorové pomocné T buňky (Th), jako jsou Th1, Th2, Th17, folikulární pomocné T buňky a regulační T buňky . Mezi těmito podskupinami byly jako první definovány typy Th1 a Th2. Buňky Th1 vylučují vysoké hladiny interferonu (IFN-) γ a jsou účinné v obraně proti intracelulárním patogenům aktivací makrofágů, zatímco buňky Th2 vylučují interleukin (IL-) 4, IL-5 a IL-13 a chrání hostitele před infekcí helminty náborem eozinofilů a žírných buněk . Ačkoli jsou tyto pomocné T buňky důležité pro obranu hostitele, chronická aktivace kteréhokoli typu Th buněk může způsobit imunitně zprostředkované poruchy. Th1 buňky hrají rozhodující roli v orgánově specifické autoimunitě a chronických zánětlivých poruchách a Th2 buňky jsou zodpovědné za alergický zánět .

Oddenek Atractylodes macrocephala Koidz (AM), patřící do čeledi Compositae, se používá k léčbě funkčních poruch trávicího systému, jako je ztráta chuti k jídlu, nadýmání břicha a průjem. Podle tradiční čínské medicíny AM oživuje Qi tím, že řeší abnormální zadržování tekutin v trávicím traktu. AM je součástí různých složených receptů na posílení čchi. V tradiční čínské medicíně je jednou ze základních funkcí Qi obrana. Z tohoto důvodu se předpokládá, že byliny posilující Qi posilují imunitní systém. Vzhledem k tomu, že byliny posilující Qi se užívají preventivně ke zlepšení imunitního stavu jedinců bez zjevných poruch, je nutné vyhodnotit, jak se může imunitní systém změnit u normálních jedinců po podání AM. Navzdory častému užívání bylo provedeno jen málo studií, které by zkoumaly účinky AM na imunitní systém.

AM obsahuje několik bioaktivních seskviterpenoidů, jako je atraktylenolid I, atraktylenolid II a atraktylenolid III a polyacetyleny . Ošetření makrofágů in vitro atraktylenolidem I, atraktylenolidem III a některými polyacetylenovými sloučeninami inhibovalo lipopolysacharidem (LPS) indukovanou expresi TNF-α a iNOS . Perorální podávání těchto složek rozpustných v lipidech vykazovalo protizánětlivou aktivitu u myší . Většina tradičních bylinných přípravků je však založena na odvarech ve vodě, což vede k nízkému výtěžku farmakologicky aktivních složek rozpustných v lipidech. Kromě toho se polyacetyleny mohou ve vroucí vodě snadno zničit. Proto jsme se chtěli zabývat otázkou, zda dochází k protizánětlivým reakcím v makrofázích izolovaných od myší, kterým byly podávány AM extrahované ve vroucí vodě (AME). Zkoumali jsme také vliv AME na zánětlivou odpověď séra. Nakonec jsme zkoumali složení a funkční odpověď splenocytů na případné změny v adaptivním imunitním systému po suplementaci AME.

2. Materiály a metody

2.1. Materiály a metody

2.2. Složení a funkční odpověď splenocytů Příprava vzorku

AM pocházející z Eusungu (Jižní Korea) byl zakoupen od společnosti E-Pulip Co., Ltd. (E-Pulip Co., Ltd.). (šarže EPL1356-4) (Soul, Jižní Korea). Voucherový vzorek (č. 2013-AM) byl uložen v Laboratoři bylinné imunologie na Kyung Hee University. Stručně řečeno, 100 g vzorku bylo rozemleto, extrahováno 1 l deionizované vody (DW) v refluxním přístroji a zahřívacím plášti po dobu 2 h při 95 °C a přefiltrováno přes filtrační papír Whatman číslo 2 (Whatman International, Kent, Anglie). Extrakt byl zahuštěn na rotační odparce a vysušen mrazem ve vakuu. Výtěžek AME byl 37,7 %. Pro analýzu pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) bylo 0,4 g AME rozpuštěno v 10 ml DW a sonikováno 5 min při 25 °C. Extrakt se přidal do ethylacetátu, protřepal se, aby se promíchal, a nechal se 1 min stát. Horní vrstva ethylacetátu byla přenesena a tento postup byl třikrát opakován. Poslední ethylacetátová vrstva byla zahuštěna a vysušena mrazem.

2.2. Zpracování extraktu HPLC

Vzorky byly analyzovány pomocí systému HPLC s reverzní fází (Shimadzu 20A, Kyoto, Japonsko), který se skládal z autosampleru (SIL-20A), binární pumpy (LC-20AD) a detektoru s fotodiodovým polem (SPD-20A) a byl vybaven kolonou YMC-Triart C18 (5 μm × 4,6 mm × 250 mm) (YMC, Kyoto, Japonsko). Gradientní průtoky pro systém dvou rozpouštědel (rozpouštědlo A, 0,05% kyselina fosforečná ve vodě; rozpouštědlo B, acetonitril) byly následující: A/15% B v 0 min, 85% A/15% B v 5 min, 50% A/50% B v 15 min, 50% A/50% B ve 20 min, 40% A/60% B v 25 min, 40% A/60% B ve 30 min, 15% A/85% v 35 min, 15% A/85% ve 40 min, 85% A/15% ve 42 min a 85% A/15% ve 45 min. Průtok mobilní fáze byl 1,0 ml/min s injekčním objemem 10 μl. Detekce byla provedena při vlnové délce 220 nm pro atraktylenolid III (Sigma, St. Louis, MO, USA) nebo při vlnové délce 280 nm pro atraktylenolid I (Sigma).

2.3. Zvířata

Sedmitýdenní samci myší Balb/c byli získáni od společnosti SamTaco (Osan, Jižní Korea) a byli umístěni v zařízení s kontrolovanou teplotou a vlhkostí bez patogenů a s 12hodinovým cyklem světlo-tma. Všechna zvířata prošla před pokusy týdenním přizpůsobením. Dávky byly stanoveny pomocí výpočtu extrapolovaného z rozdílu v ploše povrchu těla myši a člověka. Doporučená dávka AM pro dospělého člověka o hmotnosti 60 kg je 8-24 g surové rostliny denně nebo 3-9 g extraktu denně (na základě výtěžnosti extrakce v této studii). Dávku pro myš lze stanovit takto: ekvivalentní dávka pro člověka 50-150 mg/kg × 12,3 (přepočítací koeficient) = dávka pro myš 615-1 845 mg/kg. Na základě tohoto rozmezí dávek jsme pro tuto studii zvolili dávky 500 mg/kg a 2 500 mg/kg. Zvířata byla náhodně rozdělena do experimentálních skupin. AME byl podáván perorálně jednou denně po dobu 10 dnů. Během experimentálního období nebyly mezi skupinami zjištěny žádné rozdíly v tělesné hmotnosti. Protokol o zvířatech byl schválen Institucionálním výborem pro péči o zvířata a jejich použití na Kyung Hee University (KHUASP(SE)-15-012) a o myši bylo pečováno v souladu se specifikacemi Národní výzkumné rady USA pro péči o laboratorní zvířata a jejich použití (1996).

2.4. Myši, o které bylo pečováno v souladu se specifikacemi Národní výzkumné rady USA pro péči o laboratorní zvířata (1996). Příprava makrofágů

Pro izolaci makrofágů byly myším 4 dny před usmrcením intraperitoneálně aplikovány 2 ml 3,5% sterilního thioglykolátu (BD, Sparks, MD, USA). Na konci pokusu byly myši usmrceny krční dislokací a buňky peritoneálního exsudátu byly asepticky izolovány výplachem peritonea studeným DMEM (Hyclone, Logan, UT, USA) obsahujícím 10% fetální bovinní sérum (FBS; Hyclone) a 1% penicilin-streptomycin. Po centrifugaci byly buňky resuspendovány a spočítány pomocí počítadla buněk TC20 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Příprava splenocytů

Pro izolaci splenocytů byly na konci experimentu asepticky získány sleziny. Po rozrušení sleziny mezi skleněnými sklíčky v RPMI 1640 (Hyclone) s 1% FBS a 1% penicilinem-streptomycinem byly buňky přefiltrovány přes 70 μm buněčné sítko. Po odstředění byly červené krvinky lyzovány pomocí lyzovacího pufru BD PharmLyse (BD Biosciences, San Diego, CA, USA). Buňky byly resuspendovány v RPMI 1640 s 10% FBS a 1% penicilinem-streptomycinem a spočítány pomocí počítadla buněk T20.

2.6. Intraperitoneální injekce LPS

Myším bylo na konci experimentu intraperitoneálně aplikováno 1,3 mg/kg LPS (sérotyp 055:B5, Sigma). Po 1 h byly myši anestetizovány éterem a krev byla odebrána srdeční punkcí. Bylo získáno sérum, které bylo až do analýzy uchováváno při -20 °C.

2.7. Buněčné kultury

Buňky peritoneálního exsudátu byly naneseny do 6jamkových destiček nebo 60mm misek a inkubovány přes noc při 37 °C. Po odstranění neadherentních buněk byly připojené buňky stimulovány 100 ng/ml LPS po dobu 24 h. Supernatant a buňky byly odebrány pro následné testy. Splenocyty byly naneseny na 24jamkové destičky a stimulovány protilátkou anti-CD3 (BD Biosciences) o koncentraci 2 μg/ml po dobu 48 h. Supernatant byl odebrán pro analýzu cytokinů.

2,8. Průtoková cytometrie

Buňky byly dvakrát promyty ve fosfátovém pufru (PBS) a resuspendovány v množství 1 × 106 buněk/ml v pufru FACS (PBS/0,1 % NaN3/1 % FBS). Buňky byly blokovány protilátkou proti myším CD16/CD32 (BD Biosciences) při 4 °C po dobu 5 minut a poté obarveny protilátkou proti myším SR-AI konjugovanou s fluoresceinem, protilátkou proti myším LOX1 konjugovanou s PE (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), protilátkou proti myším CD36 konjugovanou s PE, FITC-konjugovaná CD11b, PE-konjugovaná anti-CD11b, PE-konjugovaná anti-myší CD86, FITC-konjugovaná anti-myší CD4, PE-konjugovaná anti-myší CD8a, FITC-konjugovaná anti-myší CD19 a FITC-konjugovaná anti-myší IA/IE (BD Biosciences) (všechny protilátky byly ředěny 1:100) po dobu 30 minut na ledu ve tmě. Pro zobrazení nespecifické vazby byly použity odpovídající izotypové protilátky. Buňky byly promyty a resuspendovány v pufru FACS. Na průtokovém cytometru Navios (Beckman Coulter, La Brea, CA, USA) bylo získáno celkem 10 000 událostí a data byla zpracována pomocí softwaru Kaluza (Beckman Coulter).

2,9. Analýza cytokinů

Hladiny TNF-α, IL-6, IFN-γ a IL-4 v supernatantech a sérech byly stanoveny pomocí souprav BD OptEIA mouse ELISA (BD Biosciences) podle protokolu výrobce.

2.10. Test proliferace

Splenocyty (4 × 105) v 96jamkových destičkách byly stimulovány rozpustnou anti-CD3 mAb (2 μg/ml) po dobu 48 h. Buněčná proliferace byla stanovena pomocí soupravy CellTiter96 One Solution Cell Proliferation assay (Promega, Madison, WI, USA).

2.11. Izolace RNA a PCR v reálném čase

Celková RNA byla izolována pomocí sady FavorPrep Total RNA Purification Kit (Favorgen Biotech, Pingtung, Taiwan) a cDNA byla reverzně přepsána pomocí sady High Capacity RNA-to-cDNA kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Zředěná cDNA byla smíchána s Master směsí Power SYBR Green PCR (Applied Biosystems) a 2 pmol primerů specifických pro iNOS, COX2 nebo GAPDH. Amplifikace cDNA byla provedena pomocí systému StepOnePlus pro PCR v reálném čase (Applied Biosystems). Po počáteční tepelné denaturaci při 95 °C po dobu 10 minut byly podmínky PCR nastaveny na 95 °C po dobu 15 sekund a 60 °C po dobu 1 minuty pro 40 cyklů. Pro každou PCR byl jako negativní kontrola zařazen odpovídající vzorek mRNA bez reverzní transkripce. Kvantifikace počtu kopií cDNA byla provedena pomocí standardní křivky.

2.12. Statistická analýza

Údaje byly prezentovány jako průměrná standardní chyba průměru (SEM). K porovnání rozdílů mezi skupinami byl použit oboustranný Studentův t-test nebo dvoucestná analýza rozptylu. Pokud statistická analýza ukázala, že rozdíly mezi více skupinami jsou významné, byl pro další srovnání použit Tukeyho post hoc test. Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí softwaru IBM SPSS verze 22.0 (IBM, Chicago, IL, USA). P-hodnoty menší než 0,05 byly považovány za signifikantní.

3. Výsledky

3.1. P-hodnoty menší než 0,05 byly považovány za signifikantní. Obsah atraktylenolidu I a atraktylenolidu III v AME

Mezi známými markery kontroly kvality jsou atraktylenolid I a atraktylenolid III ověřenými protizánětlivými sloučeninami in vitro . Ethylacetátová frakce z AME byla předběžně identifikována pomocí vstupních autentických standardů s porovnáním retenčních časů a UV-viditelných spektrálních vzorů. Chromatogramy HPLC jsou uvedeny na obrázku 1. Obsah atraktylenolidu I a atraktylenolidu III v AME byl 0,0338 mg/g extraktu a 0,565 mg/g extraktu.

(a)

(b)

(c)

(d)

.
(a)
(b)
(c)
(d)

Obrázek 1

HPLC chromatogramy vodného extraktu Atractylodes macrocephala (AME). (a, b) Standardní markery. (c, d) AME.

3.2. Znázornění AME. Vliv perorálního podání AME na expresi scavengerových receptorů v buňkách myšího peritoneálního exsudátu

Intraperitoneální injekce thioglykolátu se běžně používá k vyvolání sterilní peritonitidy a obohacení peritoneálních makrofágů z myší v laboratořích . Většina peritoneálních makrofágů pochází z krevních monocytů . Touto metodou jsme odebrali buňky peritoneálního exsudátu od myší ošetřených AME . Jako marker makrofágů byl použit CD11b . Scavengerové receptory jako SRA, CD36 a LOX-1 jsou během diferenciace monocytů na makrofágy regulovány ; proto jsme zkoumali expresi těchto proteinů. SRA, CD36 a LOX-1 byly téměř výhradně exprimovány v buňkách CD11b(+) (obrázky 2(a)-2(c)). Procento SRA(+)CD11b(+) buněk v kontrolní skupině bylo 66 % a léčba 500 mg/kg a 2 500 mg/kg AME tuto populaci významně zvýšila na 69 %, resp. 76 %. Frekvence populací CD36(+)CD11b(+) a LOX-1(+)CD11b(+) buněk v kontrolní skupině byla 95 %, resp. 14 % a AME nevyvolal žádné významné změny v obou populacích. Zvýšení populace SRA(+)CD11b(+) buněk naznačuje, že AME může stimulovat diferenciaci krevních monocytů na makrofágy v reakci na thioglykolát.

(a)

(b)

(c)

(d)

.
(a)
(b)
(c)
(d)

Obrázek 2

Scavenger receptory exprimované buňkami peritoneálního exsudátu po perorálním podání AME. Myším byl perorálně podáván AME (500 nebo 2500 mg/kg) po dobu 10 dnů. Buňky peritoneálního exsudátu byly izolovány z myší, kterým byl aplikován thioglykolát, a byly dvakrát barveny pomocí FITC-konjugovaných anti-SRA a PE-konjugovaných anti-CD11b Abs (a), FITC-konjugovaných anti-CD11b a PE-konjugovaných anti-CD36 Abs (b) nebo FITC-konjugovaných anti-CD11b a PE-konjugovaných anti-LOX-1 Abs (c). Buňky byly analyzovány pomocí průtokové cytometrie a jsou zobrazeny reprezentativní bodové grafy. (d) Sloupce představují průměr ± SEM (n=6). P <0,05, P<0,005 oproti kontrole.

3,3. Vliv perorálního podání AME na povrchovou expresi CD86 u makrofágů stimulovaných LPS

Kostimulační molekuly, jako je CD86 na makrofázích, jsou nutné k posílení vzájemného působení mezi makrofágy a Th buňkami . Peritoneální makrofágy izolované z myší léčených AME byly stimulovány LPS po dobu 24 h a membránová exprese CD86 byla měřena pomocí průtokové cytometrie. Stimulace LPS zvýšila průměrnou intenzitu fluorescence CD86 z 5,24 na 11,24 (obr. 3). Průměrná intenzita fluorescence CD86 ve skupinách 500 a 2 500 mg/kg se významně snížila na 10,14, resp. 10,59 %. Tyto výsledky naznačují, že AME může ovlivňovat interakci mezi makrofágy a Th buňkami.

(a)

(b)

(a)
(b)

Obrázek 3

Vliv AME na povrchovou expresi kostimulačních molekul u LPS-.stimulovaných makrofázích. Peritoneální makrofágy izolované z kontrolní skupiny a skupiny AME byly stimulovány 100 ng/ml LPS po dobu 24 h a poté obarveny protilátkou anti-CD86 konjugovanou s PE. (a) Jsou zobrazeny reprezentativní histogramy. (b) Sloupce představují průměr ± SEM (n=6). (-): bez LPS, (+): ošetření LPS. MFI: průměrná intenzita fluorescence. # P<0,005 oproti kontrole (-), P<0,05 oproti kontrole (+).

3,4. Účinky perorálního podání AME na zánětlivou odpověď cytokinů v makrofázích a séru

Nejprve jsme zkoumali, zda perorální podání AME ovlivňuje zánětlivou odpověď makrofágů. Peritoneální makrofágy z kontrolní skupiny nebo ze skupiny s vysokou dávkou AME byly stimulovány LPS po dobu 24 h a byla měřena produkce TNF-α a IL-6 v supernatantu. Mezi kontrolní a AME skupinou nebyl rozdíl v hladině sekrece TNF-α, ale hladina IL-6 byla u AME skupiny zvýšená (obr. 4 a)). Zjistili jsme také, že AME nevyvolává žádné změny v expresi genů iNOS a COX-2 v buňkách stimulovaných LPS (obrázek 4b). Dále jsme zkoumali systémovou odpověď myší léčených AME na intraperitoneální stimulaci LPS. AME snížil sérové hladiny TNF-α a IL-6 o 20 %, resp. 47 % (obr. 5). Tato zjištění naznačují, že protizánětlivá aktivita AME může probíhat nezávisle na modulaci makrofágů.

(a)

(b)

.
(a)
(b)

Obrázek 4

Vliv AME na zánětlivé cytokiny a enzymy u LPS-.stimulovaných makrofázích. Makrofágy izolované z kontrolní nebo AME skupiny (2500 mg/kg) byly stimulovány LPS (100 ng/ml) po dobu 24 h. (a) Hladiny tumor nekrotizujícího faktoru- (TNF-) α a interleukinu- (IL-) 6 v supernatantu byly stanoveny metodou ELISA. (b) Pro měření exprese genů iNOS a COX-2 byla použita kvantitativní PCR. Exprese cílových genů byla normalizována na expresi GAPDH. Údaje představují průměr ± SEM (n=6). (-): bez LPS, (+): ošetření LPS. # P<0,005 oproti kontrole (-), P<0,05 oproti kontrole (+).

Obrázek 5

Vliv perorálního podání AME na zánětlivé reakce séra po intraperitoneální injekci LPS. AME (2500 mg/kg) byl perorálně podáván myším po dobu 10 dnů. Sérum bylo získáno 1 hodinu po intraperitoneální injekci LPS (1,3 mg/kg) a sérové hladiny TNF-α a IL-6 byly stanoveny metodou ELISA. Údaje představují průměr ± SEM (n=10). (-): bez LPS, (+): ošetření LPS. # P<0,001 oproti kontrole (-), P <0,05, P <0,001 oproti kontrole (+).

3,5. Účinky perorálního podávání AME na populace slezinných T a B buněk a expresi MHC II

Pro zjištění, zda perorální podávání AME mění adaptivní imunitní buňky, jsme analyzovali procentuální zastoupení slezinných CD4 a CD8 T buněk a B buněk v kontrolní skupině a skupině AME. Populace CD4(+) T buněk se významně zvýšila z 23,4 % na 27,2 % a 26,9 % ve skupinách 500 a 2 500 mg/kg (obr. 6a) a 6d). V populacích CD8 T buněk a B buněk nebyly pozorovány žádné rozdíly (obrázky 6(a), 6(b) a 6(d)). Pro prezentaci antigenů buňkám CD4 T jsou nezbytné molekuly MHC II. třídy. Analyzovali jsme expresi myších molekul MHC II. třídy IA/IE ve slezině a zjistili jsme, že průměrná intenzita fluorescence molekul MHC II se významně zvýšila z 65,3 na 68,9 ve skupině 2 500 mg/kg AME (obrázky 6(c) a 6(e)). Tato zjištění naznačují, že AME vyvolává změny v adaptivním imunitním systému.

(a)

(b)

.
(c)

(d)

(e)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

Obrázek 6

Vliv perorálního podání AME na složení adaptivního imunitního systému ve slezině. Sleziny byly izolovány z kontrolní skupiny nebo ze skupiny s AME a dvojitě obarveny protilátkou anti-CD4 konjugovanou s FITC a protilátkou anti-CD8 konjugovanou s PE (a), protilátkou anti-CD19 konjugovanou s FITC (b) nebo protilátkou anti-MHC II konjugovanou s FITC (c) a hodnoceny pomocí průtokové cytometrie. (a-c) Jsou zobrazeny reprezentativní bodové skvrny nebo histogramy. (d-e) Sloupce představují průměr±SEM (n=6). P <0,001 oproti kontrole.

3,6. Účinky perorálního podání AME na proliferaci T buněk a Th1/Th2 cytokinovou odpověď ve slezinných buňkách

Zkoumali jsme funkci slezinných T buněk po podání AME. Splenocyty izolované z kontrolní skupiny nebo ze skupiny s AME byly stimulovány protilátkou anti-CD3, což je mitogen, který aktivuje celou populaci T buněk bez ohledu na specifitu antigenního receptoru. Ošetření protilátkou anti-CD3 po dobu 48 hodin zvýšilo optickou hustotu měřenou pomocí testu MTS 2,6krát. Mezi kontrolní skupinou a skupinou AME nebyl v proliferaci vyvolané protilátkou anti-CD3 žádný rozdíl (obrázek 7a). IFN-γ a IL-4 jsou reprezentativní cytokiny pro buňky Th1 a Th2. Hodnotili jsme sekreci IFN-γ a IL-4 ve splenocytech stimulovaných protilátkou anti-CD3. Ve skupině 500 mg/kg AME bylo pozorováno významné snížení sekrece IFN-γ, zatímco ve skupině 2 500 mg/kg byla sekrece IL-4 významně zvýšena (obr. 7b). Ačkoli nebyl pozorován žádný účinek závislý na dávce, AME měl tendenci podporovat Th2 odpověď.

(a)

(b)

(a)
(b)

Obrázek 7

Vliv AME na proliferaci a sekreci cytokinů aktivovaných slezinných T buněk. Splenocyty izolované z kontrolní skupiny a skupiny s AME byly kultivovány a stimulovány protilátkou anti-CD3 (2 μg/ml) po dobu 48 h. (a) Proliferační odpověď splenocytů byla stanovena pomocí testu MTS. (b) Sekrece cytokinů po 48 h stimulace byla měřena metodou ELISA. Sloupce představují průměr±SEM (n=6). (-): bez anti-CD3 protilátky, (+): ošetření anti-CD3 protilátkou. # P <0,001 oproti kontrole (-), P <0,05 oproti kontrole (+).

4. Diskuse

V tradiční čínské medicíně se od bylin posilujících Qi očekává posílení imunitního systému. V této studii jsme se konkrétně zaměřili na zánětlivé reakce makrofágů a T buněk izolovaných z myší, kterým byla perorálně podávána AME.

Tioglykolátem indukovaná sterilní peritonitida byla poprvé představena v roce 1964 Gallilym a kol. a od té doby je nejčastěji používanou metodou pro izolaci primárních makrofágů . Čtvrtý den po intraperitoneální injekci thioglykolátu se celkový počet buněk peritoneálního exsudátu zvýší přibližně 5krát . Mezi těmito buňkami převažují makrofágy, následované eosinofily . Zdrojem zvýšeného počtu peritoneálních makrofágů u myší injikovaných thioglykolátem jsou krevní monocyty pocházející z kostní dřeně . Během procesu diferenciace monocytů na makrofágy dochází k upregulaci scavengerových receptorů . Scavengerové receptory, jeden typ vrozených receptorů makrofágů, jsou zodpovědné za fagocytózu a specificky rozpoznávají polyaniontové ligandy . K identifikaci makrofágů odvozených od monocytů v buňkách peritoneálního exsudátu jsme použili CD11b a několik markerů scavengerových receptorů a zjistili jsme, že populace CD11b(+)SRA(+) buněk byla významně zvýšena ve skupině AME. To naznačuje, že podávání AME podporuje nábor a diferenciaci krevních monocytů na makrofágy v reakci na thioglykolát.

LPS je rozpoznáván komplexem toll-like receptorů (TLR)-4/MD-2.

LPS je rozpoznáván komplexem toll-like receptorů (TLR)-4/MD-2. TLR4 indukuje zánětlivé reakce prostřednictvím dvou adaptorových molekul, MyD88 a TRIF . Signální dráha závislá na MyD88 aktivuje NF-κB a mitogenem aktivovanou proteinkinázu (MAPK) a indukuje zánětlivé geny, jako jsou TNF-α a IL-6 . Signální dráha závislá na TRIF aktivuje interferonový regulační faktor-3 k produkci IFN-β, který je nezbytný pro regulaci kostimulačních molekul . Signální dráha TRIF se také podílí na aktivaci NF-κB a MAPK, ale se zpožděním oproti dráze závislé na MyD88 . Upregulace kostimulačních molekul je závislá pouze na TRIF, zatímco zánětlivé reakce jsou závislé na MyD88 a TRIF . U makrofágů ze skupiny AME nebyl zjištěn žádný inhibiční účinek na testované zánětlivé markery. Místo toho došlo ke snížení exprese CD86. CD86 na makrofázích váže CD28 na Th buňkách a posiluje tak aktivitu Th buněk . Naše výsledky naznačují, že perorální podávání AME neovlivňuje zánětlivé reakce makrofágů závislé na NF-κB a MAPK, ale specificky zasahuje do dráhy závislé na TRIF, která vede pouze k expresi CD86. K vyhodnocení, zda AME způsobuje změny v patologické situaci, kdy převažují makrofágy a Th buňky, jsou zapotřebí další studie.

Systém makrofágů stimulovaných LPS je velmi častým in vitro modelem pro hodnocení protizánětlivé aktivity přírodních produktů nebo kandidátů na léčiva. Pomocí tohoto modelu lze snadno dosáhnout požadovaného výsledku u složek rozpustných v lipidech, protože mohou snadno pronikat buněčnou membránou. Naše údaje ukázaly, že peritoneální makrofágy izolované z myší, kterým byl perorálně podáván AME, nevykazují protizánětlivé účinky ex vivo, což je v rozporu s dříve uvedenými výsledky in vitro . Naopak protizánětlivá aktivita AME byla pozorována v sérové odpovědi TNF-α a IL-6 po intraperitoneální injekci LPS. Tato systémová protizánětlivá aktivita je s nejmenší pravděpodobností zprostředkována modulací makrofágů. Jeden z rozdílů mezi podmínkami in vivo a in vitro spočívá v tom, že LPS je v cirkulaci přenášen několika lipoproteiny a poté odstraňován hepatocyty in vivo, zatímco tento děj nelze napodobit in vitro . Clearance LPS může zabránit nadměrné stimulaci jaterních makrofágů . Zda systémová protizánětlivá aktivita AME souvisí s clearance LPS v játrech, je třeba ještě určit. Podobného výsledku bylo dosaženo u peritoneálních makrofágů izolovaných z myší, kterým byl perorálně podáván vodní extrakt z Astragalus membranaceus (nepublikované údaje). Astragalus membranaceus a AM patří do stejné kategorie bylin tonizujících čchi. V současné době nevíme, zda je protizánětlivá aktivita in vivo, která nezahrnuje modulaci makrofágů, jedinečná pro tyto léčivé rostliny, nebo zda se jedná o společnou vlastnost vyvolanou léčivými rostlinami tonizujícími čchi, a k vyvození závěrů potřebujeme shromáždit více údajů. Li a kol. navíc uvedli, že atraktylenolid I a 14-acetoxy-12-senecioyloxytetradeca-2E,8E,10E-trien-4,6-diyn-1-ol, typ polyacetylenové sloučeniny izolované z AM, mají molekulární strukturu, která interaguje s membránově vázaným glukokortikoidním receptorem . Podle jejich studie byly 300 mg/kg perorálního atraktylenolidu I a 30 mg/kg perorálního polyacetylenu minimálními dávkami potřebnými k prokázání protizánětlivých účinků . Množství atraktylenolidu I v 2 500 mg/kg AME je pouhých 0,097 mg/kg, což je dávka hluboko pod požadovaným minimem. Navíc během přípravy AME muselo dojít ke ztrátě polyacetylenů. Je možné, že AME obsahuje neidentifikované sloučeniny podobné glukokortikoidům, které přispívají k jeho systémové protizánětlivé aktivitě.

K udržení správné imunitní odpovědi je zapotřebí dostatečný počet T-buněk. Za normálních podmínek je celkový počet T buněk udržován tvorbou naivních T buněk v thymu a obratem periferních naivních T buněk a paměťových T buněk. U myší a lidí dochází s věkem k atrofii brzlíku a v souladu s tím se u obou druhů snižuje produkce naivních T buněk . Pokud však jde o udržování naivních T buněk, myši produkují naivní T buňky během svého života, zatímco dospělí lidé udržují tuto populaci dělením periferních naivních T buněk . Kromě toho je životnost myších naivních T buněk 40krát kratší než životnost jejich lidských protějšků . Paměťové T buňky se udržují přerušovaným dělením . Přesný mechanismus přežívání a homeostatické proliferace naivních a paměťových T buněk není zcela definován, ale zahrnuje signály z komplexu TCR/MHC a cytokiny, jako jsou IL-7 a IL-15 . Prodloužený účinek vakcín závisí na paměťových T buňkách, zatímco léčba lymfopenických stavů vyžaduje naivní T buňky. Neurčili jsme, zda populace splenických CD4 T buněk, která se zvýšila po léčbě AME, sestávala z naivních CD4 T buněk nebo paměťových CD4 T buněk. Podrobná charakterizace buněčné frakce, která reaguje na AME, pomůže upřesnit, která situace je pro aplikaci AME vhodnější.

Pozoruhodné je, že ve skupině s AME došlo současně k upregulaci molekul MHC II. třídy ve slezině. Molekuly MHC II. třídy jsou nezbytné pro poskytování antigenů buňkám CD4 T. Rutinně jsme zjistili, že většina buněk exprimujících MHC třídy II ve slezině jsou B buňky a zbývající buňky jsou makrofágy a dendritické buňky. Neobjasnili jsme, které typy buněk vykazují upregulaci molekul MHC II. třídy po podání AME. Nicméně zvýšení počtu CD4 T buněk i exprese molekul MHC II. třídy ve slezině naznačuje, že suplementace AME přispívá k systémovému udržení CD4 T buněk. Úkolem IL-4 za fyziologických podmínek je posílit protilátkovou odpověď podporou přežívání a proliferace B buněk a zajistit obranu proti helmintové infekci . Splenocyty skupin s AME vykazovaly zvýšenou produkci IL-4 během aktivace T buněk ex vivo současně se sníženou produkcí IFN-γ . Tyto výsledky naznačují, že AME za normálních podmínek podporuje odpověď Th2. Naproti tomu perorální podání glykoproteinu odvozeného od AM podporuje Th1 odpověď a zároveň snižuje Th2 odpověď v alergickém modelu . Není jasné, zda tato sloučenina představuje celou aktivitu AM. Je zapotřebí další studie, která by určila, zda AME zabraňuje patologickým reakcím Th2 nebo je naopak zhoršuje.

5. Zda AME zabraňuje patologickým reakcím Th2 nebo je naopak zhoršuje. Závěr

V této studii jsme pozorovali změny v odpovědích makrofágů a T buněk u normálních myší po perorálním podání AME. AME zvýšil diferenciaci monocytů indukovanou thioglykolátem v peritoneu a potlačil hladiny TNF-α a IL-6 v séru indukované LPS. Na rozdíl od těchto systémových protizánětlivých účinků nebyly protizánětlivé účinky patrné u makrofágů izolovaných ze skupiny AME, s výjimkou změn v expresi kostimulačních molekul. AME také ovlivnila adaptivní imunitní systém zvýšením počtu CD4 T buněk a exprese molekul MHC II. třídy a podporou Th2 odpovědi oproti Th1 odpovědi.

Zkratky

AM:	Atractylodes macrocephala Koidz
AME:	AM vodní extrakt
LPS:	Lipopolysacharid
TNF-α:	Tumor necrosis factor-α
IL:	Interleukin
APC:	Antigen prezentující buňka
TCR:	T buněčný receptor
MHC:	Major histokompatibilní komplex
Th buňka:	T pomocná buňka
DW:	Deionizovaná voda
FBS:	Fetální hovězí sérum
PBS:	Fosfátový pufrovaný roztok
iNOS:	Inducible nitric oxide synthase
COX-2:	Cyclooxygenase-2
TLR:	Toll-like receptor
IFN-γ:	Interferon-γ
MAPK:	Mitogenem aktivovaná protein kináza.

Dostupnost údajů

Údaje použité na podporu výsledků této studie jsou na vyžádání k dispozici u odpovídajícího autora.

Konflikty zájmů

Autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů.

Poděkování

Tento výzkum byl podpořen Programem základního vědeckého výzkumu prostřednictvím Korejské národní výzkumné nadace financované Ministerstvem školství (2014R1A1A2055052).

.