Výměnu H-D původně měřil otec vodíkové výměny Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang pomocí hustotních gradientových trubic. V moderní době se H-D výměna sleduje především metodami: NMR spektroskopie, hmotnostní spektrometrie a neutronová krystalografie. Každá z těchto metod má své výhody i nevýhody.
NMR spektroskopieEdit
Jádra vodíku a deuteria se svými magnetickými vlastnostmi hrubě liší. Proto je možné je rozlišit pomocí NMR spektroskopie. Deuterony nebudou pozorovány v 1H NMR spektru a naopak protony nebudou pozorovány v 2H NMR spektru. Pokud jsou v 1H NMR spektru vysoce deuterovaného vzorku pozorovány malé signály, označují se jako zbytkové signály. Lze je použít k výpočtu stupně deuterace v molekule. Analogické signály se ve 2H NMR spektrech nepozorují, protože citlivost této techniky je ve srovnání s 1H analýzou nízká. Deuterony obvykle vykazují velmi podobné chemické posuny jako jejich analogické protony. Analýza pomocí 13C NMR spektroskopie je také možná: různé hodnoty spinu vodíku (1/2) a deuteria (1) dávají vzniknout různým násobkům štěpení. NMR spektroskopii lze použít k určení deuterace molekul specifické pro dané místo.
Další metoda využívá spektra HSQC. Obvykle se HSQC spektra zaznamenávají v sérii časových bodů během výměny vodíku s deuteriem. Protože experiment HSQC je specifický pro vodík, signál bude exponenciálně klesat při výměně vodíku. Na data je pak možné dosadit exponenciální funkci a získat výměnnou konstantu. Tato metoda poskytuje informace specifické pro všechna rezidua v proteinu současně. Hlavní nevýhodou je, že vyžaduje předchozí přiřazení spektra pro daný protein. To může být velmi pracné a obvykle omezuje tuto metodu na proteiny menší než 25 kDa. Protože záznam spektra HSQC trvá minuty až hodiny, musí se amidy, které se rychle vyměňují, měřit pomocí jiných pulzních sekvencí.
Hmotnostní spektrometrieEdit
Hmotnostní spektrometrie s výměnou vodíku a deuteria může určit celkový obsah deuteria v molekulách, které prošly výměnou H/D. V případě, že se deuterium vymění rychle, je nutné použít jiné pulzy. Vzhledem k nutné přípravě vzorku se má obvykle za to, že poskytuje přesné měření pouze nevyměnitelných atomů vodíku. Může také zahrnovat výměnu H/D v plynné fázi nebo výměnu v roztokové fázi před ionizací. V NMR spektroskopii má několik výhod, pokud jde o analýzu H/D výměnných reakcí: je zapotřebí mnohem méně materiálu, koncentrace vzorku může být velmi nízká (až 0,1 uM), velikostní limit je mnohem větší a data lze obvykle získat a interpretovat mnohem rychleji.
Jádro deuteria je dvakrát těžší než jádro vodíku, protože obsahuje neutron i proton. Molekula, která obsahuje část deuteria, bude tedy těžší než molekula, která obsahuje pouze vodík. S rostoucí deuterizací bílkoviny se odpovídajícím způsobem zvyšuje její molekulová hmotnost. Zjištění změny hmotnosti proteinu při deuteraci umožnila moderní hmotnostní spektrometrie proteinů, o níž poprvé informovali Katta a Chait v roce 1991.
Zjištění deuterace specifické pro dané místo pomocí hmotnostní spektrometrie je složitější než použití NMR spektroskopie. Například místo a relativní množství deuteriové výměny podél peptidové páteře lze přibližně určit tak, že se protein podrobí proteolýze poté, co byla uhasena výměnná reakce. U jednotlivých peptidů se pak analyzuje celková deuterace každého peptidového fragmentu. Při použití této techniky je rozlišení deuteriové výměny určeno velikostí peptidů vzniklých během rozkladu. Pro proteolýzu se běžně používá pepsin, kyselá proteáza, protože během proteolytické reakce musí být udržováno zhášecí pH. Aby se minimalizovala zpětná výměna, musí se proteolýza a následná hmotnostně spektrometrická analýza provést co nejrychleji. Separace peptického rozkladu pomocí HPLC se často provádí při nízké teplotě těsně před hmotnostní spektrometrií elektrosprejem, aby se minimalizovala zpětná výměna. V poslední době se kvůli lepším separačním schopnostem používá UPLC.
V roce 1999 bylo navrženo, že by mohlo být možné dosáhnout rozlišení jednotlivých reziduí pomocí kolizí indukované disociace (CID) fragmentace deuterovaných peptidů ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií. Brzy se zjistilo, že CID způsobuje „skramblování“ polohy deuteria v peptidech. Fragmentace způsobená MALDI in-source decay (ISD), elektronovou záchytnou disociací (ECD) a disociací s přenosem elektronů (ETD) však probíhá za správných experimentálních podmínek s malým nebo žádným skramblováním. Skramblování izotopového značení je způsobeno kolizním ohřevem před disociací iontu a zatímco CID způsobuje skramblování, ke koliznímu ohřevu může dojít také během ionizace a transportu iontu. Pečlivou optimalizací parametrů přístroje, které způsobují zahřívání iontů, však lze minimalizovat skramblování vodíku na úroveň, která zachová izotopové značení v roztokové fázi, dokud nebude možné provést fragmentaci pomocí techniky, při níž ke skramblování nedochází. V poslední době se jako možná fragmentační technika pro lokalizaci deuteria v peptidech a proteinech zkoumá také ultrafialová fotodisociace (UVPD). V tomto ohledu byly závěry nejednotné, zatímco je možné získat fragmenty UVPD, které za určitých podmínek neprošly skramblováním, jiné ukázaly, že ke skramblování může dojít jak u peptidů, tak u proteinů během samotného kroku fragmentace UVPD. Současná teorie konsolidující tyto zdánlivé rozpory souvisí s dvojí cestou fragmentace, která může vzniknout při ozáření peptidů a proteinů UV zářením, tj. přímou a statistickou disociací. To znamená, že pokud experimentální podmínky upřednostňují přímou disociaci a prekurzorový iont je před a během fragmentace udržován na nízkých vnitřních energiích, deuteriová hladina výsledných fragmentů bude odpovídat neskramblovanému prekurzoru. Experimentální podmínky však mohou podporovat statistickou disociaci během ozařování UV zářením, zejména při dlouhých dobách ozařování a nízkém tlaku plynu, což vede k vnitřní přeměně elektronické excitační energie přispívající fotony UV záření. Výsledkem je vibrační excitace ozářené molekuly, která následně podléhá skramblování.
Neutronová krystalografieUpravit
Výměnu vodíku a deuteria u rychle se měnících druhů (např. hydroxylových skupin) lze kvantitativně měřit s atomovým rozlišením pomocí neutronové krystalografie, a to v reálném čase, pokud výměna probíhá během difrakčního experimentu.
Vysoce intenzivní svazky neutronů se obvykle generují spallováním v linakových urychlovačích částic, jako je Spallation Neutron Source. Neutrony difraktují krystaly podobně jako rentgenové záření a lze je použít k určení struktury. Atomy vodíku, které mají v biologickém prostředí jeden až nula elektronů, difraktují rentgenové záření slabě a za běžných experimentálních podmínek jsou prakticky neviditelné. Neutrony se rozptylují od atomových jader, a proto jsou schopny detekovat atomy vodíku a deuteria.
Atomy vodíku jsou běžně nahrazovány deuteriem, které vnáší silný a kladný faktor rozptylu. Často stačí nahradit pouze rozpouštědlo a labilní atomy vodíku v bílkovinném krystalu difuzí par. V takové struktuře se obsazení vyměnitelného atomu deuteria v krystalu zpřesní od 0 do 100 %, což přímo kvantifikuje množství výměny.
.