Zlepšení rozpustnosti rekombinantních proteinů pomocí MBP tagu

Zdroje „Centra technických zdrojů „Technické zdroje pro proteiny „Technické zdroje pro proteiny Poznámky „MBP tag

E. Exprese v bakterii Coli

Generování rekombinantního proteinu vyžaduje použití expresního hostitele a E. coli je pro tento účel obvykle nejlepší volbou. Kombinace jednoduché genetiky, snadné kultivace, rychlé exprese a vysokých výtěžků z ní činí atraktivního hostitele, zatímco nedostatek účinného posttranslačního mechanismu, zkreslené použití kodonů a obtíže při produkci proteinů s vyšší molekulovou hmotností ji činí nevýhodnou. Jedním z největších nešvarů při expresi v E.coli je však nerozpustná exprese – jev, při němž nadměrná exprese rekombinantů vede k tvorbě nerozpustných proteinových agregátů zvaných inkluzní tělíska.

Způsoby, jak se vypořádat s inkluzními tělísky a zlepšit rozpustnost cílového proteinu

Pokud se inkluzní tělíska vytvoří, vědci obvykle zkoušejí těžkopádný proces zvaný solubilizace a opětovné skládání proteinu in vitro, aby získali zpět rozpustný protein, nebo zkoušejí optimalizaci exprese na úrovni procesu nebo molekuly, aby předešli problémům s nerozpustností .

Příklady optimalizace na úrovni procesu zahrnují metody, které nevyžadují cílové inženýrství. Například optimalizace podmínek exprese, úprava růstových a indukčních podmínek, změna médií, pufrů atd. Alternativou by bylo vyzkoušet molekulární přístup a manipulovat s cílovým proteinem odstraněním nežádoucích prvků v jeho sekvenci vytvořením zkrácení nebo mutací některých aminokyselin, aby byl protein lépe rozpustný. Mohli byste také zvolit racionální přístup mutageneze řízené podle místa na základě informací o struktuře nebo zvolit přístup řízené evoluce a provést screening rozpustnosti náhodných bodových mutantů, delecí a fragmentů. Lepším a jednodušším přístupem by bylo přijmout strategii fúzního partnera a použít předřazeného fúzního partnera, který by učinil cílový protein rozpustnějším.

Přístup fúzního partnera ke zlepšení rozpustnosti proteinu

Při tomto přístupu se obtížně exprimovatelný protein nebo peptid fúzuje s jiným, stabilním, vysoce rozpustným proteinem s cílem stabilizovat expresi s tím, že fúzní protein bude řídit výslednou expresi. Ačkoli je mnoho proteinů vysoce rozpustných, ne všechny jsou účinné jako zesilovače rozpustnosti proteinů. V tomto ohledu může být maltose Binding Protein velmi užitečným partnerem pro rozpustnost proteinů . Ve srovnávací studii zaměřené na zkoumání jejich vlastností zvyšujících rozpustnost proteinů se značka E. coli MBP ukázala být mnohem účinnějším partnerem pro rozpustnost proteinů než proteiny glutathion-S-transferáza (GST) a thioredoxin (TRx).

Obrázek 1: Doporučení vědců společnosti GenScript týkající se návrhu konstrukce

O značce MBP a jejím mechanismu účinku

MBP je přibližně 42 kDa, přirozeně se vyskytující protein v E. coli, kódovaný genem malE, který je zodpovědný za příjem, rozklad a transport maltodextrinu, sacharidu. Původně byl vyvinut jako značka pro expresi proteinů v 80. letech 20. století a je známo, že významně zvyšuje rozpustnost různých cílových proteinů, které jsou následně fúzovány. Ačkoli přesný mechanismus zvýšení rozpustnosti proteinů pomocí značky MBP není jasný, je známo, že stabilizuje a chrání svůj následný pasažérský protein před proteolytickou degradací během syntézy proteinů a po ní. Cytoplazmatické výtěžky proteinů fúzovaných s MBP jsou také obvykle vyšší, protože fúzní protein poskytuje spolehlivé souvislosti pro účinnou iniciaci translace. Předpokládá se také, že značka MBP může působit jako chaperon prostřednictvím interakcí přes rozpouštědlu vystavené horké místo na svém povrchu, které stabilizuje jinak nerozpustný pasažérský protein.

Použití značky MBP

Ačkoli bylo prokázáno, že značka MBP fúzovaná buď na N- nebo C-konci zvyšuje rekombinantní rozpustnou expresi, běžným přístupem je její fúze na N-konci. Bohužel, protože žádná značka nemůže být ideální pro všechny aplikace, byly pro zvýšení univerzálnosti značek a následných aplikací vyvinuty metody kombinovaného značení pro různé potřeby. Dvě afinitní značky exprimované v tandemu spolu s místem štěpení proteázou před cílovým proteinem umožňují použití více purifikačních strategií. Začleněním značky zvyšující rozpustnost v kombinaci s purifikační značkou se dosáhne zlepšení rozpustnosti proteinu a výtěžnosti exprese, jakož i metod účinného purifikování

Obrázek 2: Obecné schéma strategie návrhu konstruktu – kombinace afinitní/rozpustné značky na N-konci, místa štěpení proteázy následovaného cílovým proteinem může poskytnout dobré výsledky, zejména pro nerozpustné cílové proteiny. S problémy s proteolytickým štěpením může často pomoci spojovací sekvence.

Purifikace proteinů značených MBP

Kromě zvýšení rozpustnosti proteinů je další výhodou použití strategie fúze MBP usnadnění purifikace následného cílového proteinu. MBP je přirozená afinitní značka, která se váže na amylosovou pryskyřici a lze ji využít pro jednostupňovou afinitní purifikaci vazbou na zesíťovanou amylosu. Rekombinantní proteiny navázané na imobilizovanou amylózu se obvykle eluují za nedenaturačních podmínek pomocí maltózy.

Nevýhody této strategie

• Odštěpení cílového proteinu může být problémem kvůli sterické překážce ze značky MBP
• Pryskyřice s amylózou může být křehká a relativně drahá
• Srážení cílového proteinu po odštěpení
• Některé fúzní proteiny MBP se neváží účinně na pryskyřici s amylózou, a i když ano, výtěžnost může být problematická

Závěr

Ačkoli neexistuje jednoduché, globální řešení pro řešení problémů s nerozpustností v E.coli, dobře navržený konstrukt a pečlivě vypracovaná expresní strategie vám mohou poskytnout požadovaný rozpustný protein. MBP je spolehlivá značka rozpustnosti pro výrobu rekombinantních rozpustných proteinů, a přestože rozpustnost je jedním z nejdůležitějších prvků kampaně na výrobu proteinů, konečným cílem by neměla být vždy rozpustnost. Úroveň exprese, aktivita proteinu, čistota, homogenita a stabilita jsou důležité faktory, které je rovněž třeba vzít v úvahu před zahájením kampaně na výrobu rekombinantního proteinu.

Málo publikací, které prokazují užitečnost značky MBP

Výroba fusokinů pomocí MBP -Maltose-.Binding Protein Fusion Allows for High Level Bacterial Expression and Purification of Bioactive Mammalian Cytokine Derivatives (září 2014)

The rescue of aggregation-prone proteins using MBP -Rescuing aggregation-prone proteins in Escherichia coli with a dual His₆-MBP tag (May 2014)

MBP for soluble protein production in E. coli -Hexahistidinem značený maltózu vázající protein jako fúzní partner pro produkci rozpustných rekombinantních proteinů v Escherichia coli (2009)

1. Pryor, K. A., a Leiting, B. (1997). Vysokoúrovňová exprese rozpustného proteinu v Escherichia coli pomocí fúzního systému s dvojitou afinitou His6-tag a maltose binding protein. Protein Expr. Purif. 10, 309-319
2. Routzahn, K. M. a Waugh, D. S. (2002). Diferenciální účinky doplňkových afinitních značek na rozpustnost fúzních proteinů MBP. J. Struct. Funct. Genomics 2, 83-92
3. Nallamsetty, S., Austin, B. P., Penrose, K., J., and Waugh, D. S. (2005) Gateway vectors for the production of combinatorially tagged His6-MBP fusion proteins in the cytoplasm and periplasm of Escherichia coli. Protein Sci. 14, 2964-2971
4. Esposito D, Chatterjee DK: Zvýšení exprese rozpustných proteinů pomocí fúzních značek. Curr Opin Biotechnol 2006, 17:353-8.184.
5. Peti W, Page R: Strategies to maximize heterologous protein expression in Escherichia coli with minimal cost. Protein Expr Purif 2007, 51:1-10.]
6. Wilkes D.M., Expression and purification of the first nucleotide-binding domain and linker region of human multidrug resistance gene product: comparison of fusions to glutathione S-transferase, thioredoxin and maltose-binding protein. Biochemical Journal 1999, 77-81
7. Fox JD, Kapust RB, Waugh DS: Single amino acid substitutions on the surface of Escherichia coli maltose-binding protein can have a profound impact on the solubility of fusion proteins. Protein Sci 2001, 10:622-630

Plánujete projekt bakteriální exprese? Získejte během několika sekund bezplatnou cenovou nabídku na naše balíčky garantované exprese proteinů BacPower™.

Cenové nabídky a objednávání

#Automatická cenová nabídka bude vygenerována pouze v případě, že sekvence splňují podmínky pro službu Garantovaná exprese, jak je určeno naší vlastní platformou pro analýzu sekvencí, v opačném případě vás bude kontaktovat náš technický account manager s nabídkou výroby proteinu na míru. Ujišťujeme vás, že naše zakázkové služby jsou stejně kvalitní a konkurenceschopné jako naše garantované služby.

Naši zástupci zákaznického servisu jsou vám k dispozici 24 hodin denně od pondělí do pátku.