Isolering og identifikation af flygtige stoffer
Den menneskelige næse opfatter mange VOC’er som lugte, og disse lugte er ofte vores første indikation af, at der er skimmelsvampe til stede. Kemisk karakterisering (isolering, adskillelse, identifikation og kvantificering) af VOC’er kræver imidlertid specialiserede analysemetoder, som ikke ligner de metoder, der anvendes i traditionel “våd” kemi. Teknologiske fremskridt i slutningen af det 20. og begyndelsen af det 21. århundrede har forbedret vores evne til at påvise flygtige stoffer præcist, nøjagtigt og ved lave koncentrationer (Zhang og Li, 2010; Hung et al., 2015). Kort fortalt omfatter traditionelle metoder dampdestillation og væske-væskeekstraktion efterfulgt af koncentration og kemisk verifikation af de enkelte forbindelser. Nogle af de tidligste undersøgelser af VOC’ernes kemiske karakter blev udført ved hjælp af methylenkloridekstrakter, der blev koncentreret ved dampdestillation og analyseret ved gas-væske-kromatografi og massespektrometri (MS). I en tidlig undersøgelse, hvor denne metode blev anvendt, blev VOC’erne fra Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus oryzae og Aspergillus parasiticus analyseret. Alle fire arter dannede 3-methylbutanol, 3-octanon, 3-octanol, 1-octen-3-ol, 1-octenol og 2-octen-1-ol. For A. niger bestod over 90 % af den identificerede VOC-blanding af 1-octen-3-ol, som er den lugtforbindelse, der giver svampene deres karakteristiske lugt. For A. parasiticus udgjorde 1-octen-3-ol 35,6 % af den samlede flygtige blanding, mens den beslægtede forbindelse med otte kulstofatomer, 2-octen-1-ol, som har en ubehagelig lugt af mostolie, udgjorde 34,8 % (Kamiński et al., 1974).
Metoderne har siden da været baseret på gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS), som kombinerer kromatografisk adskillelse, identifikation ved hjælp af massespektrer og kromatografisk retention og kvantificering af flygtige prøver. VOC’er i headspace fra svampekulturer opsamles normalt ved hjælp af faste sorptive materialer som f.eks. aktivt kul eller fibre. Hver enkelt opsamlingsmetode har iboende bias og kan give mulighed for artefaktdannelse; generelt høstes upolære forbindelser fortrinsvis frem for polære forbindelser. Gaskromatografi kan også medføre fejl, idet det undertiden er vanskeligt at adskille to forbindelser fra hinanden, hvilket resulterer i en sammenblanding af dem. Dette er blevet konstateret i forbindelse med 2-methyl-1-butanol og 3-methyl-1-butanol, isomerer, som kun adskiller sig ved at omlægge en methylgruppe (Börjesson et al., 1992). Andre ulemper ved GC-MS-analyse er bl.a., at der er behov for dygtige operatører, at den er relativt dyr, og at den ikke er effektiv i forbindelse med mere reaktive VOC’er (Elke et al., 1999; Gao et al., 2002; Gao og Martin, 2002; Rappert og Müller, 2005).
Mikroekstraktion i fast fase (SPME) er en populær og bærbar metode. VOC’er absorberes og koncentreres først på en fiber og leveres senere til detektoren, hvor desorptionen sker i selve GC-injektoren. SPME er velegnet til udtagning af miljøprøver, som derefter transporteres tilbage til laboratoriet med henblik på identifikation. Sammen med GC-MS er det et praktisk og meget anvendt middel til kvalitativ identifikation af VOC’er fra mikrobielle kulturer eller fra forurenede bygninger (Fiedler et al., 2001; Wady et al., 2003; Jeleń og Grabarkiewicz-Szczesna, 2005). SPME er ofte den bedste metode til bestemmelse af den relative mængde af en flygtig målforbindelse i en eksplorativ situation eller til gentagne prøvetagningsprocesser. Den er imidlertid ikke nyttig til identifikation af nye forbindelser.
Der er udviklet mange specialiserede analysemetoder, som supplerer de klassiske GC-MS-tilgange og kan være nyttige til målrettede analyser. F.eks. er protonoverførselsreaktions-massespektrometri (PTR-MS) nyttig til udtagning af hurtige prøver og til påvisning af lave koncentrationer (Kamysek et al., 2011; Schwoebel et al., 2011). Denne metode er blevet anvendt inden for miljøvidenskab, fødevareteknologi og medicinsk diagnose (Gasperi et al., 2001; Cappellin et al, 2013).
Ved hjælp af termisk desorption (TD)-gaskromatografi/massespektroskopi er den flygtige in vitro-metabolitprofil af Aspergillus fumigatus blevet karakteriseret, hvilket indikerer en karakteristisk signatur, der indeholder monoterpenerne camphen, α- og β-pinen og limonen; og sesquiterpenforbindelserne α- og β-trans-bergamoten (Koo et al, 2014).
Selected ion flow tube-massespektrometri (SIFT-MS) har evnen til at detektere mikrobielle VOC’er med hastighed og følsomhed i en moderat kompleks gasblanding. Den er i stand til at målrette VOC’er ved lave milliardkoncentrationer og kan måle visse forbindelser i milliardkoncentrationer. I denne teknik ioniseres de samlede VOC’er i et flowrør, hvilket ikke kræver kromatografisk adskillelse (Syhre et al., 2008; Chambers et al., 2011). Metoden er blevet anvendt til at kvantificere VOC’er, der udsendes af A. fumigatus i samkultur med bakterier, som ofte findes i syge menneskers lunger. Kulturer med A. fumigatus producerede “rigelige” mængder ammoniak og de organiske svovlforbindelser methanethiol (også kendt som methylmercaptan), dimethylsulfid og dimethyldisulfid (Chippendale et al., 2014).
Simultan destillationsekstraktion (SDE) omfatter en kort silicafiber dækket med organisk materiale som stationær fase for at koncentrere VOC’er, der derefter desorberes i en varm injektor. SDE er blevet anvendt til bestemmelse af flygtige komponenter i miljø-, fødevare-, retsmedicinske, olie-, farmaceutiske og polymeranalyser med henblik på at opnå mere koncentrerede prøver (Orav et al., 1996). For eksempel er visse smagsforbindelser blevet undersøgt ved hjælp af en kombination af SDE og SPME. Smagsforbindelser kan analyseres kvantitativt ved hjælp af SDE, mens SPME anvendes til enkel, hurtig rutinescreening (Cai et al., 2001).
Multicapillary column-ion mobility spectrometer (MCC-IMS) har en følsomhed på del pr. billion-området, høj hastighed og kræver lav teknisk viden. Karakteristiske metabolitter af A. fumigatus- og Candida-arter er blevet differentieret i hovedrumsanalyser ved hjælp af denne fremgangsmåde (Perl et al., 2011).
Elektroniske næser (e-næser) omsætter flygtige stoffer til elektriske signaler baseret på interaktion med elektroniske overflader og kan anvendes til detektion af kendte forbindelser. E-næser består af en gruppe kemiske sensorer med forskellige selektiviteter, en signalforbehandlingsenhed og et system til skelnen af mønstre (Gardner og Bartlett, 1994). Forskellige VOC’er danner et karakteristisk fingeraftryk, som kan skelnes ved sammenligning med tidligere registrerede mønstre i genkendelsessystemet. Den medicinske anvendelse af e-næser fokuserede oprindeligt på bakterielle patogener eller ikke-infektiøse sygdomme som f.eks. lungekræft, kronisk obstruktiv lungesygdom og astma (Valera et al., 2012). Afhængigt af anvendelsen anvendes prøver af VOC’er fra svaberprøver, sputum, serum, afføring, ånde eller urin til diagnostiske formål. Åndeprøver er blevet anvendt til tidlig påvisning af aspergillose (de Heer et al., 2013).
Der er fortsat mange tekniske udfordringer ved arbejdet med svampe-VOC’er, og det er ofte vanskeligt at sammenligne resultater, der er opnået mellem forskellige laboratorier. Den samme svampeart kan have forskellige VOC-profiler baseret på ukendte eller ukontrollerede miljømæssige og genetiske faktorer eller ukontrollerede miljømæssige og genetiske faktorer. Desuden kan den anvendte forsøgsprotokol have en drastisk indflydelse på VOC-profilen. I arbejdet med Aspergillus flavus påviste de Lucca et al. (2010) f.eks. kun én terpen ved hjælp af SPME til at indsamle flygtige stoffer, før de blev underkastet GC-MS. Ved senere at anvende en prøvekoncentrator, inden den blev sendt til en anden GC-MS-instrumentmodel, var gruppen i stand til at skelne flere terpener (de Lucca et al., 2012). Metoden til håndtering af materialer før eksperimentering kan resultere i artefakter, og autoklavering kan medføre, at der dannes ikke-biogene flygtige stoffer (Börjesson et al., 1992). Da data ofte er inkonsistente på tværs af forsøg, har nogle forfattere sat spørgsmålstegn ved reproducerbarheden af mikrobielle VOC-emissioner (Schleibinger et al., 2002). Fremtidige arbejder med svampe-VOC’er skal være opmærksomme på de mange faktorer, der kan påvirke resultaterne. Det ville være nyttigt, hvis der blev udarbejdet retningslinjer for bedste praksis af det fællesskab af forskere, der studerer svampe-VOC’er.