Identificering, karakterisering og verifikation af proteinerne 130 og 131 som 14-3-3
Figur 1.
Figur 1. Regioner af sølvfarvede geler, der viser proteinpletterne 130 og 131 efter todimensionel elektroforese.
Panel A viser normal cerebrospinalvæske, hvor pletterne 130 og 131 er fraværende. Panel B viser cerebrospinalvæske fra en patient med Creutzfeldt-Jakobs sygdom; pilene peger på pletterne 130 og 131. Gelerne i panel C og D er fra et ekstrakt af normal menneskehjerne. Panelerne A, B og C viser det samme gelområde med isoelektriske punkter fra 4,8 til 6,0 (fra venstre til højre) på x-aksen og størrelser fra 10 til 40 kd (fra bunden til toppen) på y-aksen. Den stiplede boks i panel C skitserer det område, der er vist i panel D, fra en gel med et pH-område på 4,5 til 5,4. Pilene i panel B og C angiver placeringen af pletterne 130 og 131, som er mærket i panel D.
Resultaterne af todimensionel elektroforese til påvisning af cerebrospinalvæskeproteinerne 130 og 131 hos patienter med Creutzfeldt-Jakobs sygdom er vist i figur 1A og figur 1B. De seneste tekniske forbedringer har resulteret i en øget opløsning med seks pletter i stedet for de to (svarende til proteinerne 130 og 131), der oprindeligt blev beskrevet. For at finde en rigelig kilde til disse proteiner undersøgte vi normalt hjernevæv for at fastslå, om der findes nogen hjerneproteiner i nærheden af den konstellation af pletter, der svarer til cerebrospinalvæskeproteinerne 130 og 131. Figur 1C viser et område af en sølvfarvet gel efter to-dimensionel elektroforese af normale hjerneproteiner. Flere af proteinerne forekommer i det samme område som konstellationen 130-131, herunder to, der har samme ladning og masse som konstellationen 130-131 i cerebrospinalvæske. Identifikationen af de to pletter på grundlag af deres placering blev bekræftet ved hjælp af comigrationsundersøgelser. Plet 130 blev oprenset ved to-dimensionel elektroforese med smal rækkevidde (pH-område, 4,5 til 5,4), som vist i figur 1D.
Plet 130 blev udskilt fra 10 blots, enzymatisk fordøjet og mikrosequenseret. Der blev opnået aminosyresekvenser fra fire peptidfragmenter. Tre af disse sekvenser, Val-Thr-Glu-Leu-Asn-Glu-Pro-Leu-Xaa-Asn-Glu-Asp-Xaa-Asn-Asn-Leu-Leu-Leu-Ser-Val-Ala, Asp-Tyr-Tyr-Xaa-Tyr-Leu-Ala-Glu-Glu-Val-Ala-Thr-Gly-Glu-Lys og Asn-Val-Val-Val-Xaa-Ala-Arg-Arg-Ser-Ser-Xaa-Arg-Val-Ile-Ser-Ser-Ser-Ile-Glu-Gln, matchede sekvensen af det humane 14-3-3-3-protein, isoform eta. Den fjerde sekvens, Tyr-Ser-Glu-Glu-Ala-Xaa-Glu-Glu-Ile-Ser, passede til okse 14-3-3-3-protein, isoform gamma.
14-3-3-antistoffet reagerede specifikt med cerebrospinalvæskeproteinerne 130 og 131 på en todimensionel elektroforesetisk immunoblot, men reagerede ikke med andre cerebrospinalvæskeproteiner, hvilket bekræfter, at cerebrospinalvæskeproteinerne 130 og 131 er 14-3-3-proteiner.
14-3-3-immunoassay
Figur 2.
Figur 2. Immunfarvning for anti-14-3-3-3β polyklonalt kaninantistof efter natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-gelelektroforese.
Fane 1 viser cerebrospinalvæske fra en patient med patologiske tegn på Alzheimers sygdom, lane 2 og 3 viser cerebrospinalvæske fra to patienter med Creutzfeldt-Jakobs sygdom, lane 4 viser cerebrospinalvæske fra en normal ko, lane 5 viser cerebrospinalvæske fra en ko med eksperimentelt fremkaldt transmissibel mink-encephalopati og patologiske tegn på spongiform sygdom, lane 6 viser normalt humant serum, lane 7 viser serum fra en patient med Creutzfeldt-Jakobs sygdom, lane 8 viser et ekstrakt af normal menneskehjerne, og lane 9 viser oprenset prionprotein fra hjernen hos en patient med Creutzfeldt-Jakobs sygdom.
Den opdagelse, at de 30-kd-pletter i cerebrospinalvæsken (proteinerne 130 og 131) er 14-3-3-proteiner, førte til udvikling af en simpel immunoassay til hjælp ved diagnosticering af overførbar spongiform encephalopati. Som det fremgår af figur 2, var der i cerebrospinalvæske fra patienter med Creutzfeldt-Jakobs sygdom et 30-kd immunreaktivt bånd (spor 2 og 3), mens der ikke blev påvist et sådant bånd i cerebrospinalvæske fra raske kontroller (data ikke vist) eller fra en patient med Alzheimers sygdom (spor 1). Som forventet var 14-3-3 rigeligt i et ekstrakt af normal menneskelig hjerne (vognbane 8). 14-3-3-3-proteinet blev ikke fundet i normalt serum (vognbane 6); det blev imidlertid heller ikke påvist i serum fra patienter med Creutzfeldt-Jakobs sygdom (vognbane 7). Prionprotein oprenset fra hjernen fra en patient med Creutzfeldt-Jakobs sygdom (lane 9) krydsreagerede ikke med 14-3-3-antistoffet, hvilket bekræftede, at 14-3-3-3 ikke er et prionprotein.
Tabel 1.
Tabel 1. Cerebrospinalvæskeprøver, der er evalueret med 14-3-3-immunoassayet, i henhold til diagnose. Tabel 2.
Tabel 2. Sensitivitet og specificitet af 14-3-3-3-immunoassayet for Creutzfeldt-Jakobs sygdom.
Sig ud af 71 prøver af cerebrospinalvæske fra patienter med Creutzfeldt-Jakobs sygdom (96 procent) var positive for 14-3-3 (tabel 1 og tabel 2). Fire ud af 94 prøver (4 procent) fra patienter med andre sygdomme med demens var positive for 14-3-3-3 (tabel 1 og tabel 2) (P<0,001). Desuden var kun 1 ud af 91 prøver (1 procent) positiv (P<0,001), når patienter med demens, som vides at have haft akutte infarkter i hjernen inden for en måned før testen, blev udelukket fra analysen (P<0,001). Prøver fra alle 10 patienter med multiinfarktdemens, men uden slagtilfælde i måneden før testning, var negative for 14-3-3. Det eneste falsk positive resultat blandt cerebrospinalvæskeprøverne fra de øvrige patienter med demens var fra en patient med en klinisk diagnose af Alzheimers sygdom, som ikke var blevet verificeret ved patologiske undersøgelser.
14-3-3 blev påvist i 18 af de 66 cerebrospinalvæskeprøver (27 procent) fra patienter med andre neurologiske sygdomme, der ikke involverede demens. De 18 positive prøver var fra patienter med akut viral encephalitis, slagtilfælde (uden demens) inden for en måned før testen, subarachnoidalblødning eller Rett’s syndrom. Creutzfeldt-Jakobs sygdom kunne ikke med rimelighed indgå i differentialdiagnosen for nogen af disse lidelser.
Den samlede følsomhed af 14-3-3-immunoassayet som markør for Creutzfeldt-Jakobs sygdom var 96 procent (68 sande positive resultater divideret med 71 sande positive og falsk negative resultater; 95 procent konfidensinterval, 92 til 99 procent), og specificiteten var 88 procent (164 sande negative resultater divideret med 186 sande negative og falsk positive resultater; 95 procent konfidensinterval, 84 til 92 procent). Endnu vigtigere var specificiteten af dette assay blandt alle patienter med demens 96 procent (90 sandt negative resultater divideret med 94 sandt negative og falsk positive resultater; 95 procent konfidensinterval, 90 til 96 procent), og når de tre patienter med demens og hjerneinfarkt inden for en måned før testen blev udelukket, var immunoassayets specificitet 99 procent (90 sandt negative resultater divideret med 91 sandt negative og falsk positive resultater; 95 procent konfidensinterval, 97 til 100 procent) (tabel 1 og tabel 2).
Sammenligning af todimensionel elektroforese og immunoassay
Tabel 3.
Tabel 3. Sammenligning af todimensionel elektroforese for proteinerne 130 og 131 og 14-3-3-immunoassayet.
Vi sammenlignede den todimensionelle elektroforese for proteinerne 130 og 131 med 14-3-3-immunoassayet i 50 prøver af cerebrospinalvæske (tabel 3). 13 ud af 15 prøver fra patienter med Creutzfeldt-Jakobs sygdom var positive med begge test, og de andre 2 prøver var negative for proteinerne 130 og 131, men positive for 14-3-3-proteinet. Resultaterne af de to tests var de samme i prøver fra patienter med demenssygdomme, der ikke var forbundet med Creutzfeldt-Jakobs sygdom eller andre neurologiske lidelser. Selv om specificiteten af de to test er ens, har 14-3-3-3-immunoassayet en lidt højere følsomhed.
14-3-3-3-immunoassay hos dyr
Tabel 4.
Tabel 4. Resultater af 14-3-3-immunoassayet i prøver af cerebrospinalvæske fra dyr.
Resultaterne af undersøgelserne på dyr var i overensstemmelse med resultaterne af undersøgelserne på mennesker. Figur 2 viser analyseresultaterne i cerebrospinalvæske fra en normal ko (lane 4) og en ko med patologiske tegn på overførbar spongiform encephalopati (lane 5). Som det fremgår af tabel 4, blev der påvist 14-3-3-3-protein i cerebrospinalvæske fra seks ud af ni køer med eksperimentelt fremkaldt overførbar minkencephalopati eller scrapie. Den ene ko med kliniske træk, men uden patologiske beviser for overførbar spongiform encephalopati, havde også en positiv test. Ingen kontrolkvæg havde positive testresultater. Testen var positiv hos fem ud af seks får med naturligt erhvervet scrapie og var negativ hos det ene kontrolfår. Alle 15 eksperimentelt inficerede chimpanser havde positive testresultater, mens ingen af de 77 kontrolchimpanser havde positive testresultater. Den samlede følsomhed af 14-3-3-immunoassayet hos dyr var 87 procent, og den samlede specificitet var 99 procent.