18O-mærkning: et værktøj til proteomik

Der præsenteres en evaluering af den proteolytiske mærkning og kvantificering af proteiner til diagnostiske formål ved hjælp af trypsin og 18O-beriget H2O. Vi viser, at sammenlignende eller relativ kvantificering kan udføres effektivt med denne fremgangsmåde. Vi har udviklet en protokol, der gør det muligt at bevare de mærkede peptider i naturligt rigeligt vand uden frygt for tilbagekobling, forudsat at pH-værdien er tilstrækkelig lav til at slukke trypsinens katalytiske aktivitet, men ikke så lav, at den fremmer kemisk tilbagekobling. Da mærkningseffektiviteten afhænger af peptidets art, findes der ikke en simpel lineær sammenhæng mellem det relative indhold af 16O/18O-bufferblanding (x) og mærkningseffektiviteten (y); den følger snarere en sandsynlighedsbaseret y = x(2)-relation. Derfor kan omfanget af peptidmærkning ved anvendelse af 16O/18O-forholdet i digestbufferblandingen afvige betydeligt fra det, der forventes på grundlag af en lineær sammenhæng. Evalueringen af den relative Ziptip-effektivitet viste et tab i prøvegenvinding, efterhånden som peptidkoncentrationen blev reduceret under normale forhold, hvilket tyder på, at der er en grænse, under hvilken der er et faldende udbytte. Desuden viste adsorptive tab som følge af Speedvac-tørring og genvinding beskedne tab (20 %), som kan variere meget (0-50 %) fra peptid til peptid. Fordøjningseffektiviteten i opløsningen af standardproteinblandinger som en funktion af koncentrationen viste et lineært fald med faldende koncentration. Dette er i overensstemmelse med enzymkinetiske virkninger og understreger en potentiel kvantificeringsfejl, som kan opstå ved evaluering af differentiel ekspression baseret på peptiddetektion. Resultaterne fra vores undersøgelser demonstrerer 18O-mærkningens styrke som et optimeringsværktøj til udvikling af proteomiske processer.