Analyse og kvantificering af in vitro myoblastfusion ved hjælp af LADD Multiple Stain

Voksent skeletmuskelvæv indeholder en population af forløberceller, kendt som satellitceller, der er ansvarlige for reparation af skeletmuskulaturen (1-3). Aktiverede satellitceller (myoblaster) migrerer til stedet for muskeltraumaet, hvor de prolifererer, differentierer og fusionerer til multinuklede myotubes (3-5). Den endelige succes af denne proces måles ved den grad, i hvilken de residente myoblaster er fusioneret under den terminale differentiering.

For at evaluere myoblastfusion in vitro eksperimentelt beregnes et fusionsindeks baseret på på påvisning af immunofluorescens ved mikroskopi. Fluorescensmærkede antistoffer anvendes til påvisning af muskelfiberstrukturproteiner såsom myosin heavy chain (MyHC) og desmin, eller alternativt kan fluorescensmærket phalloidin anvendes til at visualisere F-actin (6-9). Kerner mærkes fluorescerende ved hjælp af en DNA-bindende forbindelse som Hoechst 33258. Efterfølgende beregnes enten procentdelen af kerner i myocytter med ≤3 kerner (9) eller procentdelen af kerner i MyHC-positive myotubes (10). Disse metoder er veletablerede; de kræver imidlertid omfattende og tidskrævende optimering for at generere et stærkt og specifikt signal for det pågældende antigen og efterfølgende fusionsanalyse. Hvis der anvendes fluorescensmærkede antistoffer, er adgang til et fluorescensmikroskop et yderligere krav, som ikke er tilgængeligt i alle institutioner. Efterfølgende kvantificering kræver en besværlig og tidskrævende analyse af mange synsfelt for at opnå et fusionsindeks, der er repræsentativt for populationen. Disse begrænsninger, sammen med de relative omkostninger ved antistofbaserede assays, fik os til at udvikle et hurtigt og omkostningseffektivt in vitro-assay til kvantificering af myoblastfusion ved hjælp af den almindeligt tilgængelige LADD Multiple Stain.

LADD Multiple Stain (11) er en kombineret nukleær og cytoplasmatisk farvning, der indeholder fuchsin og toluidinblåt (Cat. #70955; LADD Research Industries, Williston, VT). Til vores undersøgelser fremstilles frisk LADD til at indeholde 0,365 g toluidinblåt (kat. nr. 89640-5G; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og 0,135 g fuchsin (kat. nr. 47860-25G; Sigma-Aldrich) i et slutvolumen på 50 ml 30 % ethanol. Opløsningen blandes, indtil den er opløst, og filtreres derefter gennem Whatman-filterpapir (nummer 4) (kat. nr. 09-825B, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). LADD-farve kan opbevares i en plast- eller glasbeholder ved stuetemperatur og kan genbruges. Celler, der skal farves, vaskes med fosfatbufferet saltvand (PBS) og fikseres i 70 % ethanol i 10 minutter. Ethanolet fjernes, og der tilsættes 500 µL LADD-farve, således at cellerne dækkes fuldstændigt. Cellerne inkuberes i 1 min., hvorefter farvestoffet fjernes, og cellerne vaskes gentagne gange med destilleret vand, indtil LADD ikke længere udvaskes i vandet. Cellerne tørres derefter og opbevares ved stuetemperatur, indtil de kan ses ved hjælp af fase-kontrast-lysmikroskopi. For at forbedre belysningen under visning kan de farvede celler nedsænkes i PBS.

For at afgøre, om denne farvning med succes kan anvendes til at visualisere myoblastfusion, blev C2C12-celler dyrket til 80 % konfluens (figur 1A) under standardkulturbetingelser (12). Medierne blev derefter ændret til differentieringsmedier indeholdende 2 % hesteserum, hvilket resulterede i fusion til myotuber (Figur 1B). En vellykket differentiering blev bekræftet ved øget ekspression af MyHC (Figur 1D) sammenlignet med udifferentierede celler (Figur 1C). Efter LADD-farvning viser de udifferentierede C2C12-myoblaster et lyslilla cytoplasma og en mørkere kerne (Figur 1E; pil). Efter differentiering fremstår myotubecytoplasmaet imidlertid mørklilla (Figur 1F; pilespidser), mens lysere kerner er tydeligt synlige inden for den multinukleerede celle (Figur 1F; pil). Derfor observeres der efter LADD Multiple Stain klart definerede kerner, som er lige så let at skelne fra cytoplasmaet i den multinukleerede myotube (figur 1F) som set ved hjælp af fluorescensmikroskopi efter immuncytokemi (figur 1D).

For at afgøre, om billedanalyse kunne bruges til at måle myoblastfusionens fremskridt, blev C2C12-celler differentieret i 6 dage, og billeder af LADD-farvede celler blev taget ved 200× forstørrelse ved hjælp af et Olympus CKX41 inverteret lysmikroskop (Olympus Corporation, Tokyo, Japan). Som forventet steg antallet af fusionerende myocytter og myotuber klart for hver efterfølgende differentieringsdag (Figur 2A). Der blev derefter beregnet et fusionsindeks, og man kunne se, at differentierende myoblaster gradvist øgede deres fusionsindeks fra 0,45 % (dag 1) til 31,4 % (dag 6) (figur 2B). Det fusionsindeks, der er udledt på denne måde, kan sammenlignes positivt med det indeks, der er beregnet ved hjælp af standard immuncytokemi (til påvisning af MyHC) og kernefarvning (13). For at afgøre, om ImageJ-analysesoftwaren (https://imagej.nih.gov/ij/) kunne tilpasses til at kvantificere myofibers areal (som et mål for fusion), blev der udviklet en makro og testet på billederne repræsenteret i figur 2A. Makroen er opsat som følger og derefter gemt:

• Åbn ImageJ, og klik på “Plugins = > Macros = > Startup Macros”

• Udskift den eksisterende tekst med den kodning, der er vist i Supplerende tabel S1.

Billederne åbnes i ImageJ, og makroen køres ved at klikke på “Macros = > Run Macro”. Herved analyseres billederne et ad gangen. Brugeren skal bekræfte, at tærskelværdien er indstillet korrekt; kun myofibreområdet skal analyseres. Farvetærsklen kan ændres ved at redigere makrolinjen “setThreshold(0,130)”; ved at øge det andet tal vil flere let farvede områder blive medtaget, mens flere områder udelukkes, når dette tal reduceres. Ved hjælp af denne metode nåede myofiberarealet op på 29,6 % på dag 6 (figur 2C), hvilket stemmer godt overens med det fusionsindeks, der blev beregnet for samme tidspunkt (figur 2B). Jenner- og Giemsa-farvestoffer kan også bruges til farvning af myotuber til lysmikroskopi på stort set samme måde som LADD, men farvning med LADD er mange gange hurtigere, og den ImageJ-makro, vi har udviklet, giver større kontrol over, hvilke områder der måles (14).

For yderligere at validere brugen af LADD Multiple Stain til fusionsanalyse blev C2C12-celler differentieret i 5 dage i tilstedeværelse eller fravær af 10 µM BB94 (Cat. #ab142087; Abcam, Cambridge, UK) og efterfølgende fikseret og farvet med LADD som beskrevet tidligere. BB94 er en kommercielt tilgængelig syntetisk matrixmetalloproteaseinhibitor, som tidligere har vist sig at reducere myoblastfusion (15,16). I tilstedeværelse af BB94 faldt fusionsindekset signifikant fra 50% (DMSO-kontrol) til 22% (P < 0,05) (Figur 2D); analyse af myofibreområdet viste den samme tendens, med fusion reduceret fra 46% (DMSO-kontrol) til 21% (P < 0,05) (Figur 2D); analyse af myofibreområdet viste den samme tendens, med fusion reduceret fra 46% (DMSO-kontrol) til 21% (P < 0.05) i tilstedeværelsen af BB94 (Figur 2E).

Her præsenterer vi en hurtig, ny metode til farvning af både myofibers struktur og tilknyttede myonukler ved hjælp af LADD Multiple Stain. ImageJ bruges efterfølgende til nøjagtigt at vurdere muskelfiberarealet som et mål for fusion. Den relativt lave pris på LADD og den stærkt reducerede tid, der kræves til behandling og analyse, betyder, at fusion nu hurtigt kan analyseres i et standardlaboratorium uden behov for immuncytokemi og fluorescensmikroskopi.