Axial opløsning

1.43.2 Argumentet for superopløsningsmikroskopiteknikker

Laterale og aksiale opløsninger i lysmikroskopet er grundlæggende diffraktionsbegrænsede i forholdet mellem lysets bølgelængde og åbningen, eller acceptvinklen, af den objektivlinse, der anvendes til billeddannelse, som beskrevet af Ernst Abbe i 1873. I den laterale dimension er denne opløsningsgrænse ca. 200 nm, og i den aksiale dimension er grænsen ca. 500 nm. Diffraktionsgrænsen i optisk mikroskopi skyldes de grundlæggende begrænsninger i den optik, der anvendes til billeddannelse. Hvis vi betragter det billede, der dannes af en sfærisk lyskilde med underopløsning, finder vi, at det billede, der dannes af selv perfekt korrigeret, aberrationsfri mikroskopoptik, ikke er beskrevet af en simpel kugle. Faktisk observeres der en kompleks 3D-intensitetsfordeling i brændpunktet, og denne 3D-intensitetsfordeling kan matematisk beskrives ved hjælp af punktspredningsfunktionen (PSF) (figur 1). Det centrale maksimum af PSF’en indeholder 86,5% af den samlede tilgængelige energiintensitet. I både laterale og aksiale dimensioner er den resterende energiintensitet kortlagt i en række maksima og minima på en rotationssymmetrisk måde. Det er samspillet mellem PSF’er fra tilstødende billedelementer, der i sidste ende bestemmer lysmikroskopets diffraktionsopløsningsgrænse.

Figur 1. XY (a) og XZ (b) intensitetskort for en ideel punktspredningsfunktion.

Når to objekter nærmer sig hinanden i rummet, overlapper deres PSF’er hinanden, og snart kan de to objekter ikke skelnes fra hinanden. Det minimale overlap af to PSF’er, der kan tolereres, før man mister evnen til at skelne de to objekter fra hinanden, er blevet beskrevet som værende det punkt, hvor intensiteten falder med ca. 25 % mellem de to PSF’er. Det punkt, hvor dette intensitetsfald er nået, svarer til afstanden mellem det centrale maksimum og det første minimum i PSF’en. Det er meget vanskeligt at bestemme denne afstand nøjagtigt, da det er vanskeligt at placere minimummet præcist, og i stedet anvendes FWHM (full-width half-maximum) for det centrale maksimum af PSF’en.

Af begge ligninger fremgår det, at de laterale og aksiale opløsninger afhænger af den numeriske apertur i det optiske system, der opsamler lyset, og af selve lysets bølgelængde. Forbedret opløsningsevne opnås ved at anvende objektivobjektiver med høj numerisk apertur og kortere bølgelængder af lyset. Andre faktorer som f.eks. de to objekters relative lysstyrke (kontrast) har indflydelse på denne minimale opløselige afstand. I praksis er det ved billeddannelse i mikroskoper nødvendigt med både tilstrækkelig optisk numerisk apertur og tilstrækkelig kontrast for at kunne se subcellulære detaljer nøjagtigt.

Sænkning af belysningsbølgelængden til det ultraviolette område for at forbedre opløsningen begrænser ens valg af fluorescerende prober og skubber grænserne for optiske korrektioner og transmissionsegenskaberne i mikroskopets optiske vej. Yderligere komplikationer skyldes brugen af ultraviolet belysning i undersøgelser af levende celler, hvor mange forskere har bemærket de skadelige virkninger af disse bølgelængder på cellernes levedygtighed på lang sigt. Moderne optiske konstruktioner har forbedret linsernes numeriske aperture, selv om den reelle forbedring i denne henseende kun er sket ved brug af eksotiske monteringsmedier og dækglasmaterialer. Begge disse strategier giver ikke mere end en beskeden forbedring af opløsningen, og de er uhensigtsmæssige til studier af levende celler.

Biologisk konfokal mikroskopi, som anvender en pinhole-åbning til at forbedre kontrasten i fokus ved effektiv fjernelse af strejgelys fra objektplaner uden for fokus, er blevet et standard billeddannelsesværktøj til undersøgelse af cellulære struktur-funktionsforhold . Den forbedrede visualisering af billedplanet i fokus gør det lettere at nå de praktiske diffraktionsgrænser for opløsning, når instrumentet er kritisk justeret. Teoretisk set forbedres den laterale og aksiale opløsning med en pinhole-åbning på mindre end 1 Airy-enhed faktisk til en grænse på 1,4 gange så høj som ved bredfeltsmikroskopet. I praksis giver pinhole-diametre på under 1 Airy-enhed imidlertid for lidt lys til biologisk billeddannelse, da en stor del af emissionen inden for fokus afvises af pinhole-åbningen sammen med det uønskede ufokuserede lys. Ved biologisk billeddannelse, hvor man normalt kæmper for at opnå emissionssignalet, er det upraktisk at afvise en del af dette begrænsede signal for at opnå en lille opløsningsforøgelse. Når emissionssignalet fra prøven er begrænset, vælger man faktisk normalt at åbne pinhole til en diameter på over 1 Airy-enhed for at indsamle mere signal på bekostning af en større optisk skivetykkelse. Ved disse pinhole-diametre er det konfokale mikroskops opløsning stort set den samme som et konventionelt fluorescerende bredfeltmikroskop.

Det betyder ikke, at man ikke kan detektere objekter, der er mindre end opløsningsgrænsen – det er muligt at detektere selv på niveauet af enkeltmolekyler, og det er nu relativt ukompliceret ved hjælp af moderne detektorteknologier. Den fuldstændige fjernelse af den direkte belysning, der kommer ind i objektivet ved mørkfeltmikroskopi, skaber en fremragende kontrast, så selv den lille mængde lys, der spredes af diffraktionsbegrænsede objekter som mikrotubuli (25 nm i diameter), let kan observeres. Fluorescensmikroskopi giver også fremragende kontrastforhold, der kan gøre det muligt at observere og registrere objekter, hvis dimensioner ligger langt under opløsningsgrænsen for diffraktion. Ved TIRF-mikroskopi (total internal reflection fluorescence) forbedres kontrasten i forhold til standard bredfeltsfluorescensmikroskopi ved at begrænse den aksiale excitation til nogle få hundrede nanometer af grænsefladen mellem væske og glasdække ved at anvende den evanescerende lysenergi i nærfeltet til excitation af fluorofore. Under disse betingelser kan selv enkeltmolekylers mobilitet følges over tid inden for et meget tyndt optisk snit. Hverken mørkfelt- eller TIRF-mikroskopi forbedrer imidlertid opløsningen af det optiske system – begge teknikker er afhængige af store kontrastforskelle mellem det interessante objekt og baggrunden for at muliggøre subopløsningsdetektion.

Det har været en stor udfordring i moderne lysmikroskopi at overskride de klassiske diffraktionsopløsningsgrænser. Fordelene ved at forbedre vores evne til at opløse finere detaljer fra det optiske mikroskop er indlysende. Større opløsning ville give mulighed for en mere præcis strukturel beskrivelse af molekylære organisationer, der er grundlæggende for normal og unormal cellulær fysiologi og adfærd. Molekylære og biokemiske dissektioner kan kun i begrænset omfang afsløre kompleksiteten i funktionelle organisationer, som f.eks. dem, der findes ved adhæsionsfokuskontakter. Hvis vi kunne visualisere disse funktionelle organisationer direkte med opløsninger, der nærmer sig den molekylære dimension, ville det i væsentlig grad øge vores forståelse af molekylære sammenhænge og ændringer i organisationen i forbindelse med funktionelle eller fysiologiske tilstande. For nylig har en række forskere udnyttet flere forskellige strategier til at opnå væsentlige (2- til 10-dobbelte eller bedre) forbedringer af de klassiske laterale og aksiale opløsningsgrænser . Disse teknikker falder i to generelle kategorier: de teknikker, der er afhængige af ændringer i belysningen af prøven, og de teknikker, der anvender enkeltmolekyl-detektionsstrategier sammen med tidsdimensionen for at opbygge et superopløst billede.

I denne artikel er der valgt de teknikker, der har ført til udvikling og introduktion af kommercielle instrumenter fra flere producenter. Anvendelsen af dette specifikke kriterium ved udvælgelsen af de metoder, der diskuteres nedenfor, skal på ingen måde tolkes som en anbefaling af disse teknikker frem for andre, der er blevet introduceret i litteraturen. Efterhånden som der udvikles yderligere arbejde på dette hurtigt skiftende område, kan det være, at nye metoder og tilgange overhaler de nedenfor beskrevne metoder og tilgange. Indførelsen af disse kommercielle instrumenter på markedet gør det imidlertid muligt for en bred vifte af biologer fra forskellige fagområder at anvende superopløsningsmetoder på deres egne specifikke biologiske spørgsmål, hvorved disse metoder fjernes fra de specialiserede udviklingslaboratorier. Læserne opfordres til selv at undersøge de billeder af høj kvalitet, der findes i det supplerende online-materiale, som ledsager mange af de artikler, der henvises til.