Cellulære og molekylære reaktioner på akut kokainbehandling i neuronallignende N2a-celler: potentielle mekanisme for dens modstandsdygtighed i celledød

Materialer

Cellekultur

N2a-cellerne (CCL-131, ATCC) blev opretholdt som en monolagskultur48 og er blevet anvendt i vid udstrækning til undersøgelser af misbrugsstoffer14,49,50 eller CNS-sygdomme som Parkinsons51 eller Alzheimers sygdomme47,52,53. En af fordelene ved denne cellelinje er, at de fine morfologiske ændringer som følge af enhver kemisk eksponering let kan påvises på grund af deres større cellestørrelse. Medmindre andet er angivet, blev alle eksperimenter i vores undersøgelse udført i phenolrødtfrit RPMI-1640-medium indeholdende 10 % FBS. Celler, der blev udsået i kulturplader eller tallerkener, fik lov til at vokse 4-5 dage i inkubatoren med henblik på spontan differentiering af neuritudvækster. Alle undersøgelser blev gentaget mindst to gange.

Morfologi

Til grov cellemorfologiske evalueringer blev krystalvioletfarvede celler37 fotomikrograferet ved hjælp af EVOS Cell Imaging Systems med ×40-objektiv. I nogle undersøgelser blev morfologi eller vacuoler af krystalvioletfarvede celler taget ved hjælp af et inverteret fasekontrast IX-70 Olympus-mikroskop. Neuritudvækster blev kvantificeret ved hjælp af image J-software (National Institutes of Health).

Elektrofysiologi

Hele-celle patch clamp blev brugt til at optage fra N2a-celler, der var dyrket på plastikdækglas. Dækglassene blev vasket tre gange med ekstracellulær optagelsesopløsning indeholdende (i mM) 145 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 10 glukose og 10 HEPES (312 mOsm, pH 7,4) og blev inkuberet i denne opløsning ved stuetemperatur. Dækglasplader blev enten efterladt ubehandlede eller behandlet med 6,25 μM eller 4 mM kokain direkte i den ekstracellulære opløsning under optagelsen. Glaselektroder (modstand 1-5 MΩ) blev fyldt med intracellulær opløsning, der indeholdt (i mM) 130 KCl, 2 NaCl, 10 HEPES og 5 EGTA (292 mOsm, pH 7,4). Cellerne blev visualiseret under fasekontrast med et Nikon Eclipse Ti-U inverteret mikroskop og tilknyttet DS-Qi1 monokromt digitalkamera.

Optagelser blev foretaget med en Axopatch 200B-forstærker (Molecular Devices, CA) og digitaliseret med et Digidata 1440A-system (Molecular Devices, CA). Ioniske strømme blev optaget under en spændingsklemmeprotokol (-60 til 135 mV i 15 mV-trin, 250 ms i varighed). Spontane postsynaptiske strømme blev optaget under kontinuerlig spændingsklemme ved -80 mV i 2 min. En strømklemmeprotokol (-100 til 200 pA i 20 pA-trin, 800 ms varighed) blev anvendt til at vurdere N2a-cellernes evne til at udløse aktionspotentialer som reaktion på strømindsprøjtning. Signalerne blev filtreret ved 1 kHz og samplet ved 10 kHz. Data blev indsamlet og analyseret ved hjælp af pCLAMP 10-software (Molecular Devices, CA).

Behandlinger

En kendt mængde kokainhydrochlorid blev opløst i fosfatbufferet saltvand (PBS) som 1 M stamme lige før assaysene. For at simulere de farmakologiske in vivo-koncentrationer af kokain, der varierer fra 1 nM til 6,25 μM, blev der fremstillet flere arbejdslagre (0,04, 0,2, 0,4, 1, 2, 4, 8, 20, 40, 200 og 400 μM) i PBS; på samme måde blev der for højere kokainkoncentrationer (2, 3 og 4 mM endelig) fremstillet arbejdslagre på 80, 120 og 160 mM i PBS. Fra hver arbejdsopbevaring blev der tilsat 5 μl kokain pr. brønd for at opnå de ønskede koncentrationer og for at forhindre pH-ændringer i kulturmediet37. Det endelige volumen i hver brønd var 200 μl. Mens valget af lavere koncentrationer var baseret på rapporter om nano til lavere mikromolær kokain i CNS-celler fra narkomaner13 , var de højere koncentrationer baseret på flere in vitro-undersøgelser14,15,16. Celler med medium alene eller lige så stor mængde vehikel (PBS) i mediet tjente som kontrol, mens medium uden celler blev taget som blindprøve. På baggrund af vores tidligere undersøgelser i C6 astroglia-lignende celler6 blev kokainbehandlinger i den foreliggende undersøgelse også udført i 1 time til sammenligning. I øvrigt aftager kokainvirkningen hos narkomaner inden for denne periode for typiske mængder og indtagelsesveje33. I en delmængde af eksperimenterne blev cellerne i 96-hulsplader forbehandlet med 1 µM YM155, en inhibitor af survivin-genet, i 30 minutter efterfulgt af kokain (2-4 mM) medbehandling i 1 time og evalueret for celleviabilitet, mens cellerne i andre undersøgelser blev forbehandlet med 5 μM PIK-75, en inhibitor af Nrf-224, i 30 minutter forud for kokain medbehandling (2-4 mM) i 1 time og evalueret for celleviabilitet og GSH-niveauer.

Viabilitet og vacuolisering

Cellens levedygtighed blev vurderet ved optagelse af krystalviolet farvestof som tidligere beskrevet54,55. Omfanget af vakuolisering i cellerne blev kvantificeret i glutaraldehydfikserede celler ved optagelse af neutralt rødt farvestof som tidligere beskrevet56. Farvestoffet blev ekstraheret med 70 % ethanol og 0,37 % saltsyre, og absorbansen ved 540 nm blev målt i en pladelæser. Krystalvioletfarvede celler blev anvendt til fotomikrografi af vacuoler ved hjælp af et inverteret fasekontrast IX-70 Olympus-mikroskop med et ×40-objektiv.

Videomikroskopi

Til live-videografi blev en af de okulære linser i det inverterede fasekontrast IX-70 Olympus-mikroskop udskiftet med et standard okulært videokamerasystem. Udgangen fra videostikket blev tilsluttet en computer til billedvisualisering på skærmen ved hjælp af Electronic Ocular -R-AMCap softwareprogrammet, leveret af Zhejiang JinCheng Scientific & Technology Co., Ltd, (HangZhou, Kina). Videodokumentation blev optaget med en hastighed på 14 billeder pr. sekund.

Cellemembranintegritetsassay

Cellemembranintegritet blev bestemt ved at måle frigivelsen af cytoplasmatisk LDH med CytoTox 96 non-radioactive assay kit (Promega, Madison, WI) i henhold til producentens anvisninger. Kort fortalt blev cellerne i 96-hullers mikrotiterplader behandlet med forskellige koncentrationer af kokain (2, 3 og 4 mM) i 1 time. Derefter blev 50 μl testmedium overført til en ny 96-hullers plade, blandet med samme mængde substratblanding fra sættet og inkuberet i 30 minutter ved 37 °C. Absorbansen blev taget i en pladelæser ved 490 nm.

Måling af intracellulær ROS

Celler i 96-hulsplader blev behandlet med kokain på 2, 3 og 4 mM i 1 h, efterfulgt af farvning med et cellepermeabelt farvestof H2DCFDA (10 μM endelig) i 30 min6. Efter forsigtig vask og lufttørring af cellerne blev der tilsat PBS (100 μl/brønd). Pladerne blev aflæst med excitationsfilteret indstillet til 485 nm og emissionsfilteret til 530 nm i en automatisk læser (BioTek™ Synergy HTX multimode mikropladelæser, BioTek Instruments, Winooski, VT).

Lipidperoxidationsassay

Cellerne blev udsået med en starttæthed på 0,3 × 106 celler pr. brønd i seks brønde plader. Lipidperoxidation blev målt som tidligere beskrevet57. Kort fortalt blev cellerne efter kokainbehandling ved 2, 3 og 4 mM i 1 time høstet og centrifugeret ved 13.000 rpm på en bordmikrocentrifuge i 6 min. Alle cellepellets blev soniceret i PBS på is i 3 s og overført til glasrør. Derefter blev lysaterne blandet med 30 % trichloreddikesyre og 0,37 % thiobarbiturinsyre (TBA). Blandingen blev kogt i 10 minutter, afkølet til stuetemperatur (RT), overført til nye falconrør og centrifugeret ved 3038 × g i 10 minutter. Den klare supernatant blev overført til en 96-hullers plade, og absorbansen ved 535 nm blev målt i en mikropladelæser. Klart medium uden celler blev anvendt som blindprøve.

Generel mitokondriel metabolisk aktivitet og membranpotentiale

Celler (2 × 104) blev behandlet med forskellige koncentrationer af kokain (2, 3 og 4 mM) i 1 time i 96-hullers mikrotiterplader. Derefter blev pladerne centrifugeret ved 304 × g i 4 min, og det kokainholdige medium blev omhyggeligt bortskaffet. Efter tilsætning af frisk medium til cellerne (200 μl) blev der straks tilsat 10 μl MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethonyphenol)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, Promega) pr. brønd som tidligere rapporteret58 og inkuberet i 30 min. ved 37 °C. Absorbansen blev målt i en mikropladelæser ved 490 nm. Membranpotentialet blev analyseret i henhold til den tidligere procedure46. Ved afslutningen af 1 times behandling med kokain blev monolagscellerne overtrukket med 100 μl 0,25 % vandig glutaraldehyd til fiksering, der indeholdt Rh 123 for at give en slutkoncentration på 2,6 μM i 30 min ved RT. Supernatanten blev kasseret, og pladerne blev vasket med vand og lufttørret i emhætten. Endelig blev der tilsat 100 μl 0,1 % Triton×100 i PBS pr. brønd og inkuberet ved 37 °C i 1 time. Pladerne blev aflæst med excitationsfilteret indstillet til 485 nm og emissionsfilteret til 538 nm på en BioTek™ Synergy™ HTX multi-mode mikropladelæser.

Laktatdetektion

Studier udført på celler dyrket i et medium indeholdende 10 % FBS gav høje baggrundsværdier på grund af seruminteraktion med nogle af kitets komponenter (Trinity Biotech, Jamestown, NY). Så i vores efterfølgende undersøgelser blev 10 % FBS-holdigt medium forud for behandlingerne erstattet med reduceret serum (0,1 % FBS) i mikrotiterplader med 96 brønde (2 × 104 celler pr. brønd). Kitreagenset blev opløst i en kromogen opløsning, der bestod af 5,3 mM vanillinsyre, 2,9 mM 4-aminoantipyrin og ca. 4 enheder peberrodsperoxidase. Efter 1 times kokainbehandling blev kitreagenset tilsat direkte til brøndene (20 μl pr. 200 μl), og pladerne blev opbevaret i inkubatoren ved 37 °C til farveudvikling (5-10 min). Absorbansen fra de ubehandlede celler blev taget som kontrol, mens mediet uden celler blev taget som blindprøve. Absorbansen blev målt ved 490 nm i en mikropladelæser.

NMR-spektroskopi

Laktatfrigivelse fra cellerne blev påvist ved proton (1H+) NMR-spektroskopi. Da mængden af serum ikke forstyrrer denne metode, anvendte vi 10 % FBS i mediet i 96-hullers mikrotiterplader (2 × 104 celler/200 μl pr. brønd). Ved afslutningen af 1 times kokainbehandling blev mediet (0,15 ml pr. brønd) fra alle gentagelser (n = 12) af hver behandling samlet (1,8 ml) i de mærkede rør. Medium fra de ubehandlede celler blev anvendt som kontrol. Da de behandlede prøver indeholdt 2-4 mM kokain, blev der tilsat kokain (4 mM endelig mængde) til mediet blankt. NMR-analyser blev udført på Bruker Avance 800 (\(\nu _0\) = 800,23 MHz), der er udstyret med en TCI 800S6 H-C/N-D-05 Z-kryosonde (den maksimale z-feltgradientstyrke er 48 G/cm). For at opnå et endimensionelt (1D) NMR-spektrum blev der optaget 16 transienter, som blev samaddet med en optagelsesforsinkelse på 3 s. Der blev anvendt datapunkter (32 000) til at opnå en spektralbredde på 7500 Hz. Det dominerende vandpeak ved 4,75 ppm i spektret blev elimineret ved hjælp af WATERGATE W5-impulssekvensen20. En båndbredde på 3000 Hz langs hver side af vandtoppen blev givet som et spektralt vindue til observation af opløste toppe ved at anvende en forsinkelsestid på 333,3 μs for WATERGATE-impulsrækkerne. En ekstern standard, 3,3 mM vandig DMSO-opløsning, blev fremstillet til kvantificering af laktat i prøveopløsningen.

Måling af H2S i cellekulturmedium

Celler blev udsået med en starttæthed på 2 × 104 pr. brønd i 96-brønde plader. Før kokainbehandlingen blev der tilsat 1,64 % vandig zinkacetat59,60 (endelig: 0,041 %) til cellerne for at omdanne flygtig H2S-gas til zinksulfid under kokainbehandlingen. Efter 1 times behandling med 2, 3 og 4 mM kokain blev 17,453 mM N,N-dimethyl-p-p-phenylendiaminsulfat i 7,2 M HCl (endelig: 2,55 mM) og 26,18 mM FeCl3 i 1,2 M HCl (endelig: 3,83 mM) tilsat til brøndene og hvirvlet forsigtigt. Bobler i mediet blev fjernet ved at tilsætte 5 μl kold ethanol til alle brønde lige før aflæsning af pladerne ved 670 nm i en mikropladelæser.

ATP bioluminescensassay

Celler i 96-hullers mikrotiterplader blev behandlet med forskellige koncentrationer af kokain (2, 3 og 4 mM) i 1 time. Samlet ATP blev målt ved hjælp af bioluminescent ATP Somatic cell assay kit (FLASC, Sigma-Aldrich) i henhold til kitinstruktionerne leveret af producenten. Kort fortalt blev der ved afslutningen af behandlingen tilsat 75 μl af ATP-frigivende opløsning til frigivelse af somatiske celler pr. brønd for at lyse cellerne. Derefter blev 50 μl lysat overført til nye hvide 96-hullers plader med klar bund, som allerede indeholdt 50 μl ATP-assay mix-enzym under reduceret lys. Luminescensen blev straks målt på en BioTek™ Synergy™ HTX multi-mode mikropladelæser.

Isolering af RNA og cDNA-syntese

Cellerne blev udsået med en tæthed på 2 × 106 i kulturskåle med en diameter på 100 mm. På behandlingstidspunktet nåede cellerne omkring 65-70 % konfluens. Efter 1 times behandling med 2-4 mM kokain blev cellerne høstet ved skrabning og centrifugeret ved 1125 × g i 5 min. Samlet RNA blev isoleret i overensstemmelse med protokollen fra producenten (Qiagen Sciences, German town, MD) ved hjælp af RNeasy mini spin-kolonner. DNase I-behandling (Qiagen Sciences) blev udført på kolonnen. Samlet RNA fra kolonnen blev elueret med 20 μl RNasefrit vand. Med henblik på kvantificering blev RNA’et på is fortyndet i RNasefrit vand i forholdet 1:10. Mængden af total RNA blev målt ved hjælp af Nanodrop ND-1000-spektrofotometeret (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). RNA’et viste et forhold på >1,95 ved 260/280 nm, og det blev efterfølgende anvendt til cDNA-syntese. Et mikrogram total RNA blev anvendt til fremstilling af cDNA ved hjælp af et iScript cDNA-syntesesæt (Bio-Rad, Hercules, CA) i henhold til producentens anvisninger.

Relativ ekspression ved kvantitativ RT-PCR

Genekspressionsanalyse af Nrf-2, survivin (Birc5) og GAPDH ved qPCR blev udført i en iCycler termisk cycler med MyiQ-detektionssystem (Bio-Rad) ved hjælp af iQ SYBR Green supermix. Nrf-2, survivin og GAPDH-produkter blev syntetiseret ved separate PCR-reaktioner, der blev udført i 20 μl slutvolumen med 2 μl cDNA-prøve og 500 nM specifikke primere. Cyklusbetingelserne var som følger: 95 °C i 10 min, efterfulgt af 40 cyklusser på 95 °C i 15 s, 55 °C i 30 s og 72 °C i 30 s, mens smeltekurveanalyse efter PCR blev udført ved 55-95 °C. Den relative kvantificering af genekspressioner blev udført i henhold til 2-△△CT-metoden61 med GAPDH som den endogene kontrol. De primersekvenser, der blev anvendt til analyserne, er vist i tabel 1.

Total GSH-analyse

Efter behandling med forskellige koncentrationer af kokain (2-4 mM) i komplet medium i 1 time i 96-well mikrotiterplader blev cellerne fikseret med 0,25 % glutaraldehyd i 30 min, efterfulgt af forsigtig vask tre gange og lufttørret. Samlet cellulær GSH blev analyseret som tidligere beskrevet62. Absorbansen blev målt ved 412 nm i en mikropladelæser.

Fremstilling af helcellelysater

Til enzymanalyser blev cellerne udsået med en tæthed på 2 × 106 i kulturskåle med en diameter på 100 mm. Efter 1 times behandling med 2-4 mM kokain blev cellerne høstet ved hjælp af celleskrabere. Efter centrifugering ved 1620 × g i 5 min. blev cellepellets opbevaret ved -70 °C indtil videre brug. På dagen for analyserne blev pelleterne re-suspenderet i 0,5 ml PBS og soniceret to gange på is i 15 sekunder. Indholdet blev overført til eppendorf-rør og mikrocentrifugeret ved 5 000 rpm i 5 minutter. Supernatanterne blev overført til nye rør og anvendt til enzymassager. Proteinkoncentrationen i hvert lysat blev bestemt ved hjælp af BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL) i henhold til producentens anvisninger med bovin serumalbumin som standardreference.

Catalase assay

Det blev analyseret i henhold til den tidligere metode63. Reaktionsblandingen (450 μl) i en kvartskuvette indeholdt 50 μl cellelysat (60 μg), 250 μl 50 mM fosfatbuffer (pH 7,0). Reaktionen blev startet ved tilsætning af 150 μl 30 mM H2O2 (10 mM endelig mængde). Absorbansfaldet ved 240 nm blev overvåget i 2 minutter i et Genesys 10 S UV-Vis-spektrofotometer (Thermo Scientific, Vernon Hills, IL). Enzymaktiviteten blev beregnet ved hjælp af ekstinktionskoefficienten på 0,00706 pr. mmol pr. mmol, og enheden for enzymaktivitet blev udtrykt som mmol H2O2 nedbrudt pr. minut pr. mg protein. Derefter blev enzymaktiviteten af de behandlede prøver sammenlignet med kontrollen (100 %).

GPx-assay

Det blev analyseret i henhold til den offentliggjorte procedure64. Reaktionsblandingen (500 μl) indeholdt 1 mM GSH, 0,15 mM NADPH, 0,12 enhed glutathionreduktase (GR), 0,1 mM natriumazid i 0,1 M kaliumphosphat (pH 7,0 med 1 mM EDTA. Der blev tilsat natriumazid til reaktionsblandingen for at hæmme den endogene katalaseaktivitet. Reaktionsblandingen blev inkuberet med 60 μg prøve i 10 min. uden NADPH, og reaktionen blev startet ved tilsætning af NADPH og H2O2 i en slutkoncentration på 150 μM. NADPH-forbrugshastigheden blev overvåget ved 340 nm i 3 min. En enhed GPx-aktivitet blev defineret som den mængde enzym, der kræves for at forbruge 1 μmol NADPH/min i det koblede assay, og aktiviteten blev udtrykt pr. mg protein. Derefter blev enzymaktiviteten af behandlede prøver sammenlignet med kontrollen (100 %).

Statistisk analyse

De eksperimentelle resultater (n = antal brønde puljet fra mindst to forskellige eksperimenter) blev præsenteret som middelværdi ± SEM. Alle søjlediagrammer blev plottet ved hjælp af en GraphPad Prism Software, version 3.00 (San Diego, CA). Dataene blev analyseret for signifikans ved hjælp af envejs ANOVA og derefter sammenlignet ved hjælp af Dunnett’s eller Bonferroni’s multiple sammenligningstest. Testværdierne P < 0,05 og P < 0,01 blev anset for henholdsvis signifikante og meget signifikante.