Dobbeltresponsivt (pH/temperatur) Pluronic F-127 hydrogel lægemiddelafgivelsessystem til tekstilbaseret transdermal terapi

Karakterisering af kemisk syntetiseret TMC og PEG-HA

1H-NMR-spektre af TMC og chitosan er vist i Fig. 2A, hvor chitosan viste toppe ved 2,68 ppm for H-2 og flere toppe i intervallet 3,85-3,55 ppm for H-3 til H-6. Toppen for N-trimethylgruppen (-NMe3) i TMC blev påvist ved 3,36 ppm, hvilket bekræfter tilstedeværelsen af N-methylering og henviser til quaterniserede steder. Sammen med TMC-fremstilling ved N-methylering i et trin blev der syntetiseret et modificeret chitosanderivat med NMe2 (2,28 ppm) som et sideprodukt.

1H NMR-spektre af chitosan og TMC (A); HA og PEG-HA (B).

Som vist i fig. 2B viste HA en top ved 3,21 ppm for glucosidisk H og en aeetyl H-top ved 1,89 ppm. HA efter reaktion med OMe-PEG2000-NH2 viste et ethylen H-top (3,60 ppm) og (-NH-CH2-CH2-CH2-O-) H-toppen (2,76 ppm) for OMe-PEG2000-NH2, hvilket indikerer, at PEG-HA blev dannet med succes ved en amidkoblingsreaktion (fig. 2B). Andre toppe af PEG-HA er meget lig dem af HA.

FT-IR-spektre af chitosan og TMC er vist i fig. 3A. TMC viste karakteristiske toppe: O-H/N-H-strækning (3431 cm-1); C-H-strækning, pyranose ring (2919 cm-1); C=O-strækning, amid af NH-Ac (1654 cm-1); C-H-strækning, methyl af TMC (1503 cm-1); C-H-bøjning, CH3CO (1390 cm-1); og C-O-C-strækning (1158, 1066 cm-1). Figur 3A viser, at spektraltoppene for chitosan svarer til dem for TMC. Chitosan viste O-H/N-H-strækning ved 3421 cm-1, C-H-strækning af pyranose-ringen ved 2880 cm-1, C=O-strækning af amidet af NH-Ac ved 1654 cm-1, C-H-bøjning af CH3CO ved 1390 cm-1, og C-O-C-strækning ved 1155 og 1078 cm-1. Toppen ved 1503 cm-1 for methylgruppernes C-H-bindinger i TMC svarer til tilføjelsen af trimethylgrupper til amingrupperne i chitosan.

FTIR-spektre af chitosan og TMC (A); HA og PEG-HA (B).

De karakteristiske FTIR-toppe for PEG-HA vist i fig. 3B er O-H strækning (3428 cm-1), C-H strækning, pyranose ring (2892 cm-1), C=O strækning, NH-Ac (1644 cm-1), og C-N strækning (1473 cm-1). HA viste lignende karakteristiske toppe som PEG-HA, og spektraltoppene for HA er O-H-strækning (3438 cm-1), C-H-strækning, pyranose-ring (2899 cm-1) og C=O-strækning, NH-Ac (1615 cm-1). Toppen fundet ved 1473 cm-1 for PEG-HA indikerer amidkobling af HA med OMe-PEG2000-NH2.

Dynamisk viskositetsanalyse og rørinversionsresultater (hydrogelformuleringers termoresponsivitet)

I denne undersøgelse blev formuleringernes dynamiske viskositetsværdier målt som en funktion af temperaturen med en fast forskydningshastighed på 85 s-1, og omdannelsen af solfasen til gelfasen med temperaturen er afbildet i fig. 4I. De dynamiske viskositetsværdier (Pa.s) for de gallicsyre-belastede hydrogelformuleringer PF127/TMC/PEG-HA og PF127 ændrede sig gradvist med stigende temperatur i intervallet 5-50 °C, og fra bøjningspunktet viste begge formuleringer tydeligt en sol-gelovergang ved 37 °C. Desuden var PF127-indholdet i begge formuleringer 13,5 vægtprocent af den samlede vægt af hydrogelformuleringerne, og begge prøver viste en geleringstemperatur på 37 °C. De dynamiske viskositetsværdier for PF127/TMC/PEG-HA- og PF127-hydrogelerne ved 37 °C var henholdsvis 7,02 Pa.s og 5,6 Pa.s. Den højere dynamiske viskositetsværdi for PF127/TMC/PEG-HA end PF127 ved 37 °C skyldtes tilsætningen af TMC og PEG-HA i det PF127-baserede hydrogel-system, hvilket skabte forbedrede intermikellære interaktioner ved at øge hele systemets hydrofobicitet1. Desuden tydede den højere dynamiske viskositetsværdi for PF127/TMC/PEG-HA-hydrogelen på geleringspunktet på en bedre modstandsdygtighed over for deformation under stress. I litteraturen rapporteres det, at PF127 opfører sig som en ikke-newtonsk væske i gelfasen (37 °C), og de dynamiske viskositetsværdier varierede som en funktion af forskydningshastigheden52. PF127 i sol-fasen opførte sig som en newtonsk væske52. I den foreliggende undersøgelse var de dynamiske viskositetsværdier for formuleringer i sol-fasen ved 5 °C 0,40 Pa.s og 0,32 Pa.s for henholdsvis PF127/TMC/PEG-HA og PF127, hvilket er i god overensstemmelse med tidligere rapporterede værdier i litteraturen52.

Rørinverteringsmetoden blev anvendt til at visualisere gelering med temperaturændring ved at måle flydeevnen af PF127/TMC/PEG-HA, og systemet viste reversibel gelering med en sol-gel overgang ved 37 °C. PF127-kæderne sammen med to andre forbindelser (TMC og PEG-HA) bruger temperaturen som udløser og danner hydrogeler gennem reversibel fysisk sammenkædning af polymerkæderne53. Hydrogellerne vender tilbage til opløsningstilstanden, efter at den termiske stimulus er fjernet. Den inter-micellære aggregering af termoresponsive polymerer nær geleringstemperaturen viser en positiv entropiændring (ΔS) og en negativ ændring af den frie energi (ΔG) ved aggregering54. Vand-vand-associationerne forårsager en stigning i entropien, kendt som den hydrofobiske effekt, som er den styrende kraft for geldannelse ved LCST54.

Rheologisk undersøgelse

De reologiske parametre for formuleringerne, nemlig kompleks viskositet (fig. 5I), lagringsmodul (fig. 5II) og tabsmodul (fig. 5III), er blevet illustreret som funktion af temperaturen. Som det fremgår af figur 5, er alle de reologiske parametre stærkt afhængige af temperaturen, og sol-gel-konverteringen af begge formuleringer er startet nær 30 °C, som det fremgår af kurvernes bøjningspunkt. Efter geldannelsen viser alle de reologiske parametre for begge formuleringer sig at være meget højere end deres solfase. Værdierne for PF127/TMC/PEG-HA’s komplekse viskositet (I), lagringsmodul (II) og tabsmodul (III) er betydeligt højere end PF127’s værdier i deres geltilstand, hvilket indikerer, at den modificerede PF127-hydrogel med TMC og PEG-HA er mekanisk stærkere end PF127-hydrogeler. De forbedrede reologiske parametre for PF127/TMC/PEG-HA-hydrogel kan forekomme på grund af stærke inter-micellære interaktioner, og TMC og PEG-HA vil muligvis øge stabiliteten af miceller dannet af PF127 i hydrogelen.

Opsvulningsundersøgelse (pH-responsivitet af hydrogelformuleringer)

Opsvulningen af frysetørrede hydrogelpartikler under sur pH (pH 5,4) under anvendelse af 0,1 M acetatbuffer mod tiden (fig. 6) ved 30 °C viste, at gelpartiklerne dannet af PF127/TMC/PEG-HA i hævet tilstand modstod fuldstændig opløsning indtil 30 min, hvorefter de begyndte at blive opløst i mediet for at blive nedbrudt fuldstændigt lige efter 2 h. I modsætning hertil modstod PF127 i hævet tilstand nedbrydning indtil 15 min og blev fuldstændig nedbrudt efter 1 h. PF127’s hydrofilitet blev øget under sure forhold på grund af polymer-vand-interaktionen, hvilket resulterede i hurtig opløsning af gelstrukturen21. De frysetørrede hydrogelpartiklers pH-responsivitet blev modificeret efter tilsætning af TMC og PEG-HA i systemet, og den forbedrede inter-micellære interaktion i det modificerede hydrogel-system gjorde gelpartiklerne modstandsdygtige over for den syremedierede nedbrydning/opløsning af gelpartiklerne i længere tid.

Svulningen af gelpartikler under neutral pH (7,4) ved hjælp af 0,1 M PBS ved 30 °C viste, at hydrogelpartiklerne forblev hævede i 4 timer uden tegn på opløsning. Svulmningsforholdet for PF127/TMC/PEG-HA (5,01) ved pH 7,4 efter 4 timer var højere end for PF127 (4,23), hvilket indikerer, at det indbyrdes forbundne porøse netværk af PF127/TMC/PEG-HA akkumulerede flere vandmolekyler i deres struktur i den hævede tilstand (fig. 6).

Undersøgelse af hydrogelnedbrydning under mekanisk omrøring (mekanisk stabilitetstest)

Undersøgelsen af hydrogelnedbrydning af PF127/TMC/PEG-HA og PF127 under mekanisk omrøring (70 rpm) i 14 dage under neurale pH-betingelser viste, at PF127/TMC/PEG-HA modstod gelnedbrydning i højere grad end PF127-hydrogelen (fig. 7). Hydrogelen fremstillet af PF127/TMC/PEG-HA viste en resterende masse på 45,4 % efter mekanisk omrøring i 14 dage, mens PF127-systemet viste et større massetab efter 14 dage (resterende masse på 39,2 %). Derfor blev hydrogelens mekaniske stabilitet øget efter tilsætning af TMC og PEG-HA til PF127-polymerkæderne i formuleringen, fordi der blev dannet en mere indbyrdes forbundet hydrogelstruktur ved denne modifikation.

SEM- og TEM-undersøgelse af hydrogelformuleringer

SEM-billederne af gallicsyrebelastet PF127 (Fig. 8A,B) og PF127/TMC/PEG-HA (Fig. 8C,D) hydrogeler i frysetørret tilstand viser agglomererede porøse strukturer med uregelmæssige porestørrelser efter frysetørring, da fjernelsen af vand forårsagede, at alle indbyrdes forbundne netværk i hydrogelen blev stablet. Ikke desto mindre viser billedet af PF127/TMC/PEG-HA (forstørret blå boks i fig. 8C) i fig. 8D et bedre sammenkoblet netværk med mere karakteristiske porer end PF127 alene (forstørret rød boks i fig. 8A), da inter-micellære interaktioner af PF127-kæderne blev forbedret efter modifikation med TMC og PEG-HA55. Det indlæste lægemiddel inde i hydrogelen var relativt mere fordelagtigt fordelt inde i gelstrukturen af PF127/TMC/PEG-HA, og den vedvarende og kontrollerede lægemiddelfrigivelse var bedre i det modificerede PF127-system på grund af den mere indbyrdes forbundne porøse struktur i den oprindelige formulering.

TEM-billederne af PF127 (Fig. 8E) og PF127/TMC/PEG-HA-formuleringer (Fig. 8F) i sol-tilstand viser micellære aggregater/forbundne miceller, der varierer fra 100 til 1000 nm i størrelse, og som på billederne fremstår som granulater af varierende form, som angivet ved de røde stiplede cirkler i Fig. 8E og de blå stiplede cirkler i Fig. 8F. Som det fremgår af fig. 8, var de miceller, der blev dannet i PF127/TMC/PEG-HA (F), mere kompakte og stabile end dem, der kun var fremstillet af PF127 (E). Micellerne blev hovedsageligt dannet af PF127-polymerkæder, og TMC og PEG-HA i PF127/TMC/PEG-HA-formuleringen påvirkede dannelsen af stabile og kompakte inter-micellære strukturer eller micellære aggregater af PF127 gennem den hydrofobiske interaktion. Derfor kunne leveringssystemet af PF127/TMC/PEG-HA-hydrogelen vise god lægemiddelfrigivelse på grund af deres stabile inter-micellære strukturer.

SAXS-undersøgelse af hydrogeler

Den frysetørrede form af hydrogelerne, der var belagt på glaspladen, blev placeret parallelt med prøveholderen på instrumentet til refleksions-SAXS. Som vist i fig. 9 blev værdierne af I (a. u.) for hydrogelprøverne plottet mod q (Å-1). SAXS i refleksionstilstand udføres, når røntgenstråler rammer en flad prøve næsten parallelt med overfladen, og giver en idé om inhomogeniteten i hydrogelnetværket56. Plottet af I (a. u.) mod q (Å-1) i fig. 9 har vist, at der opstår en top ved q = 0,02 Å-1, som observeres i hydrogeler, hvilket indikerer tilstedeværelsen af frossen inhomogenitet, og dette skyldes tilstedeværelsen af et krystalliseret område med høj elektrontæthed, som stammer fra hydrogelernes iboende netværksdefekter57.

Refleksions-SAXS ved måling af I (a. u.) vs q (Å-1) af lægemiddelbelastede (A) PF127 og (B) PF127/TMC/PEG-HA-hydrogeler.

Zetapotentiale af hydrogelformuleringer

Zetapotentialet af formuleringerne i solfasen blev målt i 14 dage for at overvåge stabiliteten af komponenterne i systemet under opbevaring. Overfladeladningen af komponenterne i formuleringen bestemmer deres stabilitet, opløselighed og clearance58 , og overfladeladningen af en komponent måles ved hjælp af zetapotentialet. Både PF127- og PF127/TMC/PEG-HA-formuleringer med lægemiddel (gallicsyre) i solfasen udviste negative zetapotentialeværdier (tabel 1). PF127 i solfasen med indlæst galsyre viste et negativt zetapotentiale på -18,7 mV ± 6,1 ved 30 °C, og PF127/TMC/PEG-HA med lægemiddel (galsyre) i solfasen viste en negativ zetapotentialeværdi på -16,3 mV ± 5,9. Som det fremgår af tabel 1, var zetapotentialeværdierne for PF127 og PF127/TMC/PEG-HA henholdsvis -18,7 mV ± 6,5 og -14,6 mV ± 7,7 efter 14 dages opbevaring ved 30 °C. Derfor var alle komponenter i formuleringerne ensartet fordelt i systemet uden udfældning, da der ikke blev fundet nogen signifikant ændring i zetapotentialeværdierne for begge formuleringer i løbet af opbevaringsperioden. Desuden ændres micellernes overfladeladninger ikke væsentligt i PF127/TMC/PEG-HA-formuleringen, da TMC og PEG-HA er modsat ladede, og derfor svarer det resulterende zetapotentiale for PF127/TMC/PEG-HA til zetapotentialet for formuleringen med PF127 alene.

FTIR-undersøgelse af lægemiddelbelastede hydrogeler

Figur 10 viser de karakteristiske FTIR-toppe for PF127/TMC/PEG-HA-hydrogel belastet med gallussyre i frysetørret form (cm-1), og disse toppe er 3445 (O-H strækning), PF127, TMC, PEG-HA og gallussyre); 2891 (C-H strækning), PF127, TMC, PEG-HA og gallussyre; 1644 (C=O strækning), TMC og PEG-HA; 1282 (C-O-C strækning), PF127, TMC og PEG-HA; 1110 (C-C-O symmetrisk strækning), PF127; 964 (C-C-O asymmetrisk strækning), PF127. Lignende karakteristiske toppe blev observeret ved FTIR-analyse af PF127-hydrogel fyldt med gallicsyre. FTIR-toppene for PF127-hydrogelen fyldt med gallussyre i frysetørret form er 3445 cm-1 (O-H strækning), PF127 og gallussyre; 2891 cm-1 (C-H strækning), PF127 og gallussyre; 1282 cm-1 (C-O-C strækning), PF127; 1110 (C-C-O symmetrisk strækning) PF127; og 964 (C-C-O asymmetrisk strækning), PF127. Det brede peak, der blev fundet ved 3445 cm-1 i begge hydrogelformuleringer, tydede på, at gallussyre blev effektivt indlæst i hydrogellerne.

FTIR-spektre af lægemiddelindlæste dobbelt responsive (pH/temperatur) PF127- og PF127/TMC/PEG-HA-hydrogeler.

Studie af kumulativ frigivelse

Frigivelsesundersøgelsen blev udført for at undersøge frigivelsen af gallussyre fra PF127/TMC/PEG-HA og PF127-hydrogeler i 0,1 M PBS (pH 7,4) og ved 37 °C (fig. 11). Begge formuleringer viste en eksplosiv frigivelse af lægemidlet (gallussyre) i en indledende fase (inden for 5 timer) med 64,60 % ± 1,112 og 50,31 % ± 0,411 lægemiddelfrigivelse for henholdsvis PF127/TMC/PEG-HA og PF127-hydrogels. Efter 5 dage var der en kumulativ lægemiddelfrigivelse på 87,61 % ± 1,112 og 75,20 % ± 0,112 og 75,20 % ± 0,11 %.850 blev registreret for henholdsvis PF127/TMC/PEG-HA og PF127-hydrogeler, hvilket indikerer, at det modificerede hydrogel-system fremstillet af PF127 med TMC og PEG-HA fungerede bedre som et lægemiddelafgivelsessystem. De morfologiske ændringer af PF127/TMC/PEG-HA, såsom forbedrede inter-micellære interaktioner og en velformet porøs netværksstruktur, forbedrede lægemiddelfrigivelsen under neutrale pH-betingelser.

Kumulativ frigivelse (%) af lægemiddel (gallussyre) fra (A) PF127 og (B) PF127/TMC/PEG-HA-hydrogeler ved pH 7,4 og 37 °C i 5 dage i 0,1 (M) PBS-buffer. Data repræsenterer gennemsnittet af tredobbelte frigivelseseksperimenter ± SD og tilpasning af lægemiddelfrigivelsesdata til tre forskellige hastighedsmodeller nul-orden, første orden og Higuchi.

Figur 11 De kumulative værdier for frigivelse af lægemiddel (gallussyre) fra hydrogellerne er tilpasset med forskellige kinetiske hastighedsmodeller (fig. 11), og hastighedskonstanterne for forskellige hastighedsmodeller for alle hydrogelvarianter er angivet i tabel 2. Tilpasningen af frigivelsesdata til forskellige hastighedsmodeller er udtrykt i R2-værdier (fig. 11).

Den nul-ordens hastighedsmodel er givet ved ligningen:

hvor Qt er den kumulative mængde af lægemiddelfrigivelse fra hydrogelen på tidspunktet t (h), Qo er den oprindelige mængde af lægemiddel, der er indlæst i hydrogelen, og k0 er nul-ordens hastighedskonstanten (sek-1). Hastigheden af lægemiddelfrigivelsen ved hjælp af nul-ordens-hastighedsligningen er uafhængig af den oprindelige mængde lægemiddel, der er indlæst i hydrogelen.

Den første-ordens hastighedsmodel er givet ved følgende ikke-lineære form:

hvor Qt er den kumulative mængde af lægemiddelfrigivelse fra hydrogelen på tidspunktet t (h), Qo er den oprindelige mængde af lægemiddel, der er indlæst i hydrogelen, og k1 er første ordens hastighedskonstant (sek-1). Stofffrigivelseshastigheden ved første ordens hastighedsligning er afhængig af dets koncentration (den oprindelige stofmængde indlæst i hydrogelen).

Higuchi hastighedsligning tyder på frigivelse af stof fra hydrogeler ved diffusionsmetoden, og den ikke-lineære form af Higuchi hastighedsligningen er:

hvor Qt er den kumulative mængde af lægemiddelfrigivelse fra hydrogelen på tidspunktet t (h), og kH er Higuchi-konstanten (sek-0.5).

Passningen af frigivelsesdata til de forskellige hastighedsmodeller (Fig. 11) viser, at hydrogelformuleringernes lægemiddelfrigivelseshastighed nøje følger første ordens hastighedsligning, da både gallicsyrebelastede PF127- og PF127/TMC/PEG-HA-hydrogeler viser R2-værdier på 0,990, som er højere end dem, der er opnået fra andre hastighedsmodeller, der er anvendt i denne undersøgelse. Derfor er hastigheden for frigivelse af lægemiddel fra hydrogellerne afhængig af den oprindelige koncentration af lægemiddel, der er indlæst i hydrogellerne. Som det fremgår af tabel 2, er k1 (sek-1) lavere end andre hastighedskonstanter for begge hydrogelsorter, og derfor følger den vedvarende frigivelse af lægemiddel fra hydrogelen i højere grad første ordens hastighedsmodel end nogen anden hastighedsmodel, der er anvendt her.