Effekt af oralt administreret Atractylodes macrocephala Koidz-vandekstrakt på makrofag- og T-celle-inflammatorisk respons hos mus

Abstrakt

Rhizomet af Atractylodes macrocephala Koidz (AM) er en bestanddel af forskellige recepter med Qi booster-præparater. Vi evaluerede inflammatoriske reaktioner i makrofager og T-celler isoleret fra mus efter oral indgivelse af AM-vandekstrakt (AME). Peritoneale eksudatceller blev isoleret fra thioglycollat-injicerede mus, og ændringer i scavengerreceptorer blev undersøgt. Peritoneale makrofager blev stimuleret med lipopolysaccharid (LPS). Serumcytokinresponserne på intraperitoneal LPS-injektion blev også evalueret. Splenocytter blev isoleret, og deres sammensætning og funktionelle respons blev målt. Indholdet af atractylenolid I og atractylenolid III, kendte antiinflammatoriske ingredienser, i AME var henholdsvis 0,0338 mg/g ekstrakt og 0,565 mg/g ekstrakt. AME øgede antallet af SRA(+)CD11b(+)-celler som reaktion på thioglycollat. Peritoneal makrofager isoleret fra AME-gruppen viste ingen ændringer i inflammatoriske markører såsom tumornekrosefaktor- (TNF-) α, interleukin- (IL-) 6, inducerbar nitrogenoxidsyntase og cyclooxygenase-2, men udviste et fald i CD86-ekspression. Interessant nok nedsatte AME serumniveauerne af TNF-α og IL-6 ved intraperitoneal injektion af LPS. Med hensyn til det adaptive immunsystem øgede AME CD4(+) T-cellepopulationen og ekspressionen af major histokompatibilitetskompleks klasse II-molekylet i milten, og dyrkede splenocytter fra AME-gruppen viste øget produktion af IL-4 samtidig med nedsat interferon-γ-produktion under T-celleaktivering. AME fremmede genopfyldningen af peritoneale makrofager under det inflammatoriske respons, men dets antiinflammatoriske aktivitet syntes ikke at være medieret af en modulering af makrofagaktiviteten. AME ændrede også immunstatus for CD4 T-celler og fremmede Th2-responset.

1. Indledning

Inflammation er en beskyttende reaktion for at eliminere skadelige stimuli, og immunceller er de vigtigste deltagere i denne proces. Afhængigt af modaliteten af antigengengenkendelse og evnen til at generere hukommelsesrespons opdeles immuncellerne i det medfødte immunsystem og det adaptive immunsystem . Medfødte immunceller som f.eks. makrofager og dendritiske celler reagerer øjeblikkeligt på antigener med begrænset receptorspecificitet . Adaptive immunceller, der består af T-celler og B-celler, er antigenspecifikke, indleder et respons på et antigen, der er trængt ind i det perifere lymfoide væv, og skaber et hukommelsesrespons . De medfødte immunceller er de vigtigste aktører i de tidlige stadier af inflammation, men med tiden tager de adaptive immunceller over.

Vævsresidente makrofager spiller en central rolle for immunitet og vævsintegritet . De fleste vævsmakrofager stammer fra embryonale forstadier . Under stabile forhold opretholdes deres populationer gennem deres levetid og ved lokal proliferation, og nogle makrofager genopfyldes af blodmonocyt-afledte celler . Under betændelse rekrutteres monocytter fra knoglemarven til stedet og differentierer sig til makrofager . Makrofager eliminerer patogener og antigener gennem fagocytose og fremkalder inflammatoriske reaktioner ved at producere cytokiner og enzymer som f.eks. tumornekrosefaktor- (TNF-) α, interleukin- (IL-) 6, inducerbar nitrogenoxidsyntase (iNOS) og cyclooxygenase- (COX-) 2 . Desuden er makrofager en type professionelle antigenpræsenterende celler (APC’er), der præsenterer antigener for T-celler .

T-celler, som hovedsagelig består af CD4 T-celler og CD8 T-celler, aktiveres, når T-celle receptorer (TCR’er) kommer i kontakt med antigenpeptider bundet af MHC-molekyler (major histocompatibility complex) på APC’er . CD4 T-celler, som udgør mere end to tredjedele af T-cellerne, kan differentieres til forskellige effektor T-hjælperceller (Th-celler) såsom Th1, Th2, Th17, T-follikulære helperceller og T-regulatoriske celler . Blandt disse delmængder var Th1- og Th2-celler de første typer, der blev defineret. Th1-celler udskiller høje niveauer af interferon- (IFN-) γ og er effektive i forsvaret mod intracellulære patogener ved at aktivere makrofager, mens Th2-celler udskiller interleukin- (IL-) 4, IL-5 og IL-13 og beskytter værten mod helminth-infektioner ved at rekruttere eosinofile og mastceller . Selv om disse T-hjælperceller er vigtige for værtsforsvaret, kan kronisk aktivering af enhver Thcelletype forårsage immunmedierede lidelser. Th1-celler spiller en afgørende rolle i organspecifik autoimmunitet og kroniske inflammatoriske lidelser, og Th2-celler er ansvarlige for allergisk inflammation .

Rhizomet af Atractylodes macrocephala Koidz (AM), der tilhører Compositae, har været anvendt til behandling af funktionelle defekter i fordøjelsessystemet såsom tab af appetit, abdominal distention og diarré. Ifølge traditionel kinesisk medicin styrker AM Qi ved at afhjælpe unormal væskeophobning i mave-tarmkanalen. AM er en bestanddel af forskellige sammensatte recepter med sammensatte Qi boosters. I traditionel kinesisk medicin er en af Qi’s væsentlige funktioner forsvaret. Derfor anses Qi boostende urter for at styrke immunsystemet. Da Qi boosting herbs tages forebyggende for at forbedre immunstatus hos personer uden åbenlyse defekter, er det nødvendigt at vurdere, hvordan immunsystemet kan ændres hos normale personer efter indgivelse af AM. På trods af dens hyppige anvendelse er der kun få undersøgelser, der har undersøgt virkningerne af AM på immunsystemet.

AM indeholder flere bioaktive sesquiterpenoider såsom atractylenolid I, atractylenolid II og atractylenolid III og polyacetylenes . In vitro-behandling af makrofager med atractylenolid I, atractylenolid III og nogle polyacetylenforbindelser hæmmer lipopolysaccharid- (LPS-) induceret TNF-α- og iNOS-ekspression . Oral indgift af disse lipidopløselige komponenter viste antiinflammatorisk aktivitet hos mus . Størstedelen af de traditionelle urtepræparater er imidlertid vandbaserede afkog, hvilket resulterer i et lavt udbytte af farmakologisk aktive lipidopløselige komponenter. Desuden kan polyacetylenerne let ødelægges i kogende vand. Derfor ønskede vi at undersøge, om der opstår antiinflammatoriske reaktioner i makrofager isoleret fra mus, der har fået AM ekstraheret i kogende vand (AME). Vi undersøgte også virkningen af AME på det inflammatoriske serumrespons. Endelig undersøgte vi splenocytternes sammensætning og funktionelle respons for eventuelle ændringer i det adaptive immunsystem efter AME-tilførsel.

2. Materialer og metoder

2.1. Forberedelse af prøve

AM med oprindelse i Eusung (Sydkorea) blev købt fra E-Pulip Co., Ltd. (Lot. EPL1356-4) (Seoul, Sydkorea). Et belægseksemplar (# 2013-AM) blev deponeret i Laboratory of Herbal Immunology, Kyung Hee University. Kort fortalt blev 100 g af prøven formalet, ekstraheret med 1 l deioniseret vand (DW) i et refluksapparat og en varmemantel i 2 timer ved 95 °C og filtreret gennem Whatman-filterpapir nr. 2 (Whatman International, Kent, England). Ekstraktet blev koncentreret ved hjælp af en rotationsfordamper og frysetørret under vakuum. Udbyttet af AME var 37,7%. Til analyse ved højtydende væskekromatografi (HPLC) blev 0,4 g AME opløst i 10 ml DW og soniceret i 5 min. ved 25 °C. Ekstraktet blev tilsat ethylacetat, rystet for at blande det og lod det stå i 1 minut. Det øverste lag af ethylacetat blev overført, og denne procedure blev gentaget tre gange. Det sidste ethylacetatlag blev koncentreret og frysetørret.

2.2. HPLC

Prover blev analyseret med et omvendt fase HPLC-system (Shimadzu 20A, Kyoto, Japan), der bestod af en autosampler (SIL-20A), en binær pumpe (LC-20AD) og en fotodiode array-detektor (SPD-20A) og var udstyret med en YMC-Triart C18-kolonne (5 μm × 4,6 mm × 250 mm) (YMC, Kyoto, Japan). Gradientstrømmene for systemet med to opløsningsmidler (opløsningsmiddel A, 0,05 % fosforsyre i vand; opløsningsmiddel B, acetonitril) var som følger: 85 % A/15 % B ved 0 min, 85 % A/15 % B ved 5 min, 50 % A/50 % B ved 15 min, 50 % A/50 % B ved 20 min, 40 % A/60 % B ved 25 min, 40 % A/60 % B ved 30 min, 15 % A/85 % ved 35 min, 15 % A/85 % ved 40 min, 85 % A/15 % ved 42 min, og 85 % A/15 % ved 45 min. Flowhastigheden af den mobile fase var 1,0 ml/min med et injektionsvolumen på 10 μl. Detektion blev udført ved 220 nm for atractylenolid III (Sigma, St. Louis, MO, USA) eller ved 280 nm for atractylenolid I (Sigma).

2.3. Dyr

Syv uger gamle Balb/c-hanmus blev anskaffet fra SamTaco (Osan, Sydkorea) og opstaldet i et temperatur- og fugtighedskontrolleret patogenfrit dyreanlæg med en 12-timers lys/mørke-cyklus. Alle dyr gennemgik 1 uges tilpasning før eksperimenterne. Doser blev fastsat ved hjælp af en beregning, der blev ekstrapoleret ud fra forskellen i kropsoverfladeareal mellem en mus og et menneske . Den anbefalede dosis af AM til et voksent menneske på 60 kg er 8-24 g rå plante pr. dag eller 3-9 g ekstrakt pr. dag (baseret på ekstraktionsudbyttet i denne undersøgelse). Dosis for mus kan bestemmes på følgende måde: en humanækvivalent dosis på 50-150 mg/kg × 12,3 (omregningskoefficienten) = en musedosis på 615-1 845 mg/kg. På grundlag af dette dosisinterval valgte vi doser på 500 mg/kg og 2 500 mg/kg til denne undersøgelse. Dyrene blev tilfældigt fordelt i forsøgsgrupper. AME blev givet via oral indtagelse en gang dagligt i 10 dage. Der var ingen forskelle i kropsvægt mellem grupperne i den eksperimentelle periode. Dyreprotokollen blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Kyung Hee University (KHUASP(SE)-15-012), og musene blev passet i overensstemmelse med US National Research Council for the Care and Use of Laboratory Animals (1996) specifikationer.

2.4. Til isolering af makrofager blev musene intraperitonealt injiceret med 2 ml 3,5 % sterilt thioglycollat (BD, Sparks, MD, USA) 4 dage før ofringen. Ved forsøgets afslutning blev musene ofret ved cervikal dislokation, og peritoneale eksudatceller blev aseptisk isoleret ved peritoneal lavage med kold DMEM (Hyclone, Logan, UT, USA) indeholdende 10% føtal bovin serum (FBS; Hyclone) og 1% penicillin-streptomycin. Efter centrifugering blev cellerne resuspenderet og talt ved hjælp af en TC20 celletæller (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

2.5. Splenocyt-præparering

Til splenocyt-isolering blev milten udtaget aseptisk ved forsøgets afslutning. Efter opsplitning af milten mellem glasplader i RPMI 1640 (Hyclone) med 1% FBS og 1% penicillin-streptomycin blev cellerne filtreret gennem en 70-μm cellesieber. Efter centrifugering blev de røde blodlegemer lyseret ved hjælp af BD PharmLyse lyseringsbuffer (BD Biosciences, San Diego, CA, USA). Cellerne blev resuspenderet i RPMI 1640 med 10 % FBS og 1 % penicillin-streptomycin og talt ved hjælp af en T20 Cell Counter.

2.6. Intraperitoneal injektion af LPS

Mus blev intraperitonealt injiceret med 1,3 mg/kg LPS (serotype 055:B5, Sigma) ved afslutningen af forsøget. Efter 1 time blev musene bedøvet med ether, og blodet blev opsamlet ved hjertepunktur. Serum blev udtaget og opbevaret ved -20 °C indtil analyse.

2.7. Celledyrkning

Peritoneale eksudatceller blev udplottet i 6-well-plader eller 60-mm-skåle og inkuberet natten over ved 37°C. Efter fjernelse af ikke-adhærente celler blev fastsiddende celler stimuleret med 100 ng/ml LPS i 24 timer. Supernatant og celler blev opsamlet til efterfølgende analyser. Splenocytter blev udplottet i 24-hulsplader og stimuleret med 2 μg/ml anti-CD3-antistof (BD Biosciences) i 48 h. Supernatant blev opsamlet til cytokinanalyse.

2.8. Flowcytometri

Cellerne blev vasket to gange i fosfatbufferet saltvand (PBS) og resuspenderet ved 1 × 106 celler/ml i FACS-buffer (PBS/0,1 % NaN3/1 % FBS). Cellerne blev blokeret med rotte anti-mus CD16/CD32-antistof (BD Biosciences) ved 4 °C i 5 minutter og derefter farvet med fluoresceinkonjugeret anti-mus SR-AI, PE-konjugeret anti-mus LOX1 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), PE-konjugeret anti-mus CD36, FITC-konjugeret CD11b, PE-konjugeret anti-CD11b, PE-konjugeret anti-mus CD86, FITC-konjugeret anti-mus CD4, PE-konjugeret anti-mus CD8a, FITC-konjugeret anti-mus CD19 og FITC-konjugeret anti-mus IA/IE (BD Biosciences) (alle antistoffer blev fortyndet med 1:100) i 30 minutter på is i mørke. Der blev anvendt matchede isotype-antistoffer til at vise uspecifik binding. Cellerne blev vasket og resuspenderet i FACS-buffer. I alt 10 000 hændelser blev registreret på et Navios flowcytometer (Beckman Coulter, La Brea, CA, USA), og dataene blev behandlet ved hjælp af Kaluza-softwaren (Beckman Coulter).

2.9. Cytokinanalyse

Niveauerne af TNF-α, IL-6, IFN-γ og IL-4 i supernatanter og sera blev bestemt ved hjælp af BD OptEIA mus ELISA-sæt (BD Biosciences) i overensstemmelse med producentens protokol.

2.10. Proliferationsassay

Splenocytter (4 × 105) i 96-hulsplader blev stimuleret med opløseligt anti-CD3 mAb (2 μg/ml) i 48 h. Celleproliferation blev bestemt ved hjælp af CellTiter96 One Solution Cell Proliferation assay-sættet (CellTiter96 One Solution Cell Proliferation assay kit) (Promega, Madison, WI, USA).

2.11. RNA-isolering og realtids-PCR

Total RNA blev isoleret ved hjælp af et FavorPrep Total RNA Purification Kit (Favorgen Biotech, Pingtung, Taiwan), og cDNA blev omvendt transskriberet ved hjælp af et High Capacity RNA-to-cDNA-kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Fortyndet cDNA blev blandet med Power SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems) og 2 pmol primere, der var specifikke for iNOS, COX2 eller GAPDH. Amplifikation af cDNA blev udført ved hjælp af et StepOnePlus realtids-PCR-system (Applied Biosystems). Efter indledende varmedenaturering ved 95 °C i 10 minutter blev PCR-betingelserne indstillet til 95 °C i 15 sekunder og 60 °C i 1 minut i 40 cyklusser. For hver PCR blev der medtaget en tilsvarende mRNA-prøve uden omvendt transkription som negativ kontrol. Kvantificering af cDNA-kopienummeret blev opnået ved hjælp af en standardkurve.

2,12. Statistisk analyse

Data blev præsenteret som gennemsnitlig standardfejl af gennemsnittet (SEM). Dobbeltsidet Student’s t-test eller tovejs variansanalyse blev anvendt til at sammenligne forskelle mellem grupper. Hvis den statistiske analyse viste, at forskellene mellem flere grupper var signifikante, blev Tukey post hoc-test anvendt til yderligere sammenligning. Alle statistiske analyser blev udført med IBM SPSS 22.0 version software (IBM, Chicago, IL, USA). P-værdier på mindre end 0,05 blev anset for signifikante.

3. Resultater

3.1. Indhold af atractylenolid I og atractylenolid III i AME

Af de kendte kvalitetskontrolmarkører er atractylenolid I og atractylenolid III verificerede antiinflammatoriske forbindelser in vitro . Ethylacetatfraktionen fra AME blev forsøgsvis identificeret ved hjælp af et spiked input af autentiske standarder med sammenligning af retentionstider og UV-visible spektralmønstre. HPLC-kromatogrammerne er vist i figur 1. Indholdet af atractylenolid I og atractylenolid III i AME var henholdsvis 0,0338 mg/g ekstrakt og 0,565 mg/g ekstrakt.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figur 1

HPLC-kromatogrammer af vandekstrakt af Atractylodes macrocephala (AME). (a, b) Standardmarkører. (c, d) AME.

3.2. Virkning af oral administration af AME på ekspression af Scavenger Receptor Ekspression i mus Peritoneal Exudat Celler

Intraperitoneal injektion af thioglycollat bruges almindeligvis til at fremkalde steril peritonitis og berige peritoneale makrofager fra mus i laboratorier . Størstedelen af de peritoneale makrofager stammer fra blodmonocytter . Vi indsamlede peritoneale exudatceller fra AME-behandlede mus ved hjælp af denne metode. CD11b blev anvendt som en markør for makrofager. Scavengerreceptorer som SRA, CD36 og LOX-1 opreguleres under differentiering fra monocytter til makrofager ; derfor undersøgte vi ekspressionen af disse proteiner. SRA, CD36 og LOX-1 blev næsten udelukkende udtrykt i CD11b(+)-celler (figurer 2(a)-2(c)). Procentdelen af SRA(+)CD11b(+)-celler i kontrolgruppen var 66 %, og behandling med 500 mg/kg og 2.500 mg/kg AME øgede denne population signifikant til henholdsvis 69 % og 76 %. Frekvenserne af CD36(+)CD11b(+)- og LOX-1(+)CD11b(+)-cellepopulationerne i kontrolgruppen var henholdsvis 95 % og 14 %, og AME inducerede ingen signifikante ændringer i begge populationer. Stigningen i SRA(+)CD11b(+)-cellepopulationen tyder på, at AME kan stimulere differentieringen af blodmonocytter til makrofager som reaktion på thioglycollat.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

3.3. Effekt af oral administration af AME på overflade CD86-ekspression i LPS-stimulerede makrofager

Kostimulerende molekyler såsom CD86 på makrofager er nødvendige for at styrke crosstalk mellem makrofager og Th-celler . Peritoneale makrofager isoleret fra AME-behandlede mus blev stimuleret med LPS i 24 timer, og membranekspressionen af CD86 blev målt ved hjælp af flowcytometri. Stimulering med LPS øgede den gennemsnitlige fluorescensintensitet af CD86 fra 5,24 til 11,24 (figur 3). Den gennemsnitlige fluorescensintensitet af CD86 i 500- og 2.500 mg/kg-grupperne faldt signifikant til henholdsvis 10,14 og 10,59. Disse resultater tyder på, at AME kan påvirke interaktionen mellem makrofager og Th-celler.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 3

Effekt af AME på overfladeekspressionen af kostimulerende molekyler i LPS-stimulerede makrofager. Peritoneale makrofager isoleret fra kontrol- og AME-grupperne blev stimuleret med 100 ng/ml LPS i 24 timer og derefter farvet med PE-konjugeret anti-CD86-antistof. (a) Repræsentative histogrammer er vist. (b) Søjlerne repræsenterer gennemsnit ± SEM (n=6). (-): uden LPS, (+): LPS-behandling. MFI: gennemsnitlig fluorescensintensitet. # P<0,005 i forhold til kontrol (-), P<0,05 i forhold til kontrol (+).

3,4. Virkninger af oral administration af AME på det inflammatoriske cytokinrespons i makrofager og serum

Vi undersøgte først, om oral administration af AME påvirker det inflammatoriske respons hos makrofager. Peritoneale makrofager fra kontrol- eller højdosis AME-gruppen blev stimuleret med LPS i 24 timer, og produktionen af TNF-α og IL-6 i supernatanten blev målt. Der var ingen forskel i niveauet af TNF-α-sekretion mellem kontrol- og AME-gruppen, men niveauet af IL-6 var øget i AME-gruppen (figur 4(a)). Vi fandt også, at AME ikke inducerede nogen ændringer i iNOS- og COX-2 genekspression i celler stimuleret med LPS (Figur 4(b)). Dernæst undersøgte vi det systemiske respons hos AME-behandlede mus på intraperitoneal LPS-stimulering. AME sænkede serumniveauerne af TNF-α og IL-6 med henholdsvis 20 % og 47 % (Figur 5). Disse resultater tyder på, at den antiinflammatoriske aktivitet af AME kan forekomme uafhængigt af modulationen af makrofager.

(a)

(b)

(a)
(b)

3,5. Virkninger af oral administration af AME på miltære T-celle- og B-cellepopulationer og MHC II-ekspression

For at bestemme, om oral administration af AME ændrer adaptive immunceller, analyserede vi procenterne af miltære CD4- og CD8-T-celler og B-celler i kontrol- og AME-grupperne. CD4(+) T-cellepopulationen steg signifikant fra 23,4 % til 27,2 % og 26,9 % i henholdsvis 500 og 2.500 mg/kg-grupperne (figur 6(a) og 6(d)). Der blev ikke observeret nogen forskelle i CD8 T-celle- og B-cellepopulationerne (figurer 6(a), 6(b) og 6(d)). MHC-klasse II-molekyler er nødvendige for præsentation af antigener for CD4 T-celler. Vi analyserede den miltære ekspression af musens MHC klasse II-molekyler IA/IE og fandt, at den gennemsnitlige fluorescensintensitet af MHC II-molekyler steg signifikant fra 65,3 til 68,9 i AME-gruppen på 2 500 mg/kg (figur 6(c) og 6(e)). Disse resultater tyder på, at AME inducerer ændringer i det adaptive immunsystem.

(a)

(b)

(c)
(c)

(d)

(e)

(a)
(b)(c)
(c)
(d)
(e)

Figur 6

Virkninger af oral indgift af AME på sammensætningen af det adaptive immunsystem i milten. Splenocytter blev isoleret fra kontrol- eller AME-grupper og dobbeltfarvet med FITC-konjugeret anti-CD4-antistof og PE-konjugeret anti-CD8-antistof (a), FITC-konjugeret anti-CD19-antistof (b) eller FITC-konjugeret anti-MHC II-antistof (c) og evalueret ved hjælp af flowcytometri. (a-c) Repræsentative dotblots eller histogrammer er vist. (d-e) Søjlerne repræsenterer gennemsnit ± SEM (n=6). P <0,001 versus kontrol.

3,6. Virkninger af oral administration af AME på T-celleproliferation og Th1/Th2-cytokinrespons i splenocytter

Vi undersøgte funktionen af spleniske T-celler efter AME-behandling. Splenocytter isoleret fra kontrol- eller AME-grupper blev stimuleret med anti-CD3-antistof, et mitogen, der aktiverer hele populationen af T-celler uafhængigt af antigenreceptorspecificitet. Behandling med anti-CD3-antistof i 48 timer øgede den optiske tæthed 2,6 gange som målt ved MTS-assay. Der var ingen forskel i den proliferation, der blev induceret af anti-CD3-antistof, mellem kontrol- og AME-grupperne (figur 7(a)). IFN-γ og IL-4 er repræsentative cytokiner for henholdsvis Th1- og Th2-celler. Vi evaluerede sekretionen af IFN-γ og IL-4 i splenocytter stimuleret med anti-CD3-antistof. Der blev observeret en signifikant reduktion i IFN-γ-sekretionen i AME-gruppen på 500 mg/kg, mens IL-4-sekretionen blev signifikant forøget i gruppen på 2.500 mg/kg (figur 7(b)). Selv om der ikke blev observeret nogen dosisafhængig virkning, havde AME en tendens til at fremme Th2-responset.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 7

Virkninger af AME på proliferation og cytokinsekretion af aktiverede T-celler fra splenisk milt. Splenocytter isoleret fra kontrol- og AME-grupper blev dyrket og stimuleret med anti-CD3-antistof (2 μg/ml) i 48 h. (a) Splenocytternes proliferative respons blev bestemt ved hjælp af MTS-assayet. (b) Cytokinudskillelse ved 48 h stimulering blev målt ved ELISA. Søjlerne repræsenterer gennemsnit ± SEM (n=6). (-): uden anti-CD3-antistof, (+): behandling med anti-CD3-antistof. # P <0,001 versus kontrol (-), P <0,05 versus kontrol (+).

4. Diskussion

I traditionel kinesisk medicin forventes Qi boostende urter at styrke immunsystemet. I denne undersøgelse fokuserede vi specifikt på de inflammatoriske reaktioner hos makrofager og T-celler isoleret fra mus, der fik AME oralt.

Thioglycollat-induceret steril peritonitis blev først introduceret i 1964 af Gallily et al. og har siden da været den mest almindeligt anvendte metode til isolering af primære makrofager . På dag 4 efter intraperitoneal injektion af thioglycollat stiger det samlede antal celler i peritoneal exsudat ca. 5 gange . Blandt disse celler er makrofager den fremherskende celletype, efterfulgt af eosinofile celler . Kilden til det øgede antal peritoneale makrofager i thioglycollat-injicerede mus er blodmonocytter fra knoglemarven . Der sker en opregulering af scavengerreceptorer under differentieringsprocessen fra monocytter til makrofager . Scavengerreceptorer, der er en type af makrofagernes medfødte receptorer, er ansvarlige for fagocytose og genkender specifikt polyanioniske ligander . Vi brugte CD11b og flere scavengerreceptormarkører til at identificere monocyt-afledte makrofager i peritoneale eksudatceller og fandt, at CD11b(+)SRA(+)-cellepopulationen var signifikant forøget i AME-gruppen. Dette tyder på, at administration af AME fremmer rekruttering og differentiering af blodmonocytter til makrofager som reaktion på thioglycollat.

LPS genkendes af toll-like receptor (TLR)-4/MD-2-komplekset. TLR4 inducerer inflammatoriske reaktioner gennem to adaptormolekyler, MyD88 og TRIF . Den MyD88-afhængige signalvej aktiverer NF-κB og mitogen-aktiveret proteinkinase (MAPK) for at inducere inflammatoriske gener såsom TNF-α og IL-6 . Den TRIF-afhængige signalvej aktiverer interferonreguleringsfaktor-3 for at producere IFN-β, som er nødvendig for opregulering af kostimulerende molekyler . TRIF-signalvejen deltager også i aktiveringen af NF-κB og MAPK, men på en forsinket måde i forhold til den MyD88-afhængige vej . Opregulering af kostimulerende molekyler er udelukkende TRIF-afhængig, mens inflammatoriske reaktioner er medafhængige af MyD88 og TRIF . Der var ingen hæmmende virkning på de testede inflammatoriske markører i makrofager fra AME-gruppen. I stedet blev CD86-ekspressionen mindsket. CD86 på makrofager binder CD28 på Th-celler for at styrke Th-cellernes aktivitet . Vores resultater tyder på, at oral indgivelse af AME ikke påvirker NF-κB- og MAPK-afhængige inflammatoriske reaktioner i makrofager, men specifikt griber ind i den TRIF-afhængige vej, der kun fører til CD86-ekspression. Der er behov for yderligere undersøgelser for at vurdere, om AME forårsager ændringer i en patologisk situation, hvor makrofager og Th-celler dominerer.

Det LPS-stimulerede makrofag-system er en meget almindelig in vitro-model til evaluering af den antiinflammatoriske aktivitet af naturprodukter eller lægemiddelkandidater. Ved hjælp af denne model er det let at opnå det ønskede resultat med lipidopløselige komponenter, fordi de let kan trænge ind i cellemembranen. Vores data viste, at peritoneale makrofager isoleret fra mus, der fik AME oralt, ikke udviste antiinflammatoriske virkninger ex vivo, hvilket modsiger tidligere rapporterede in vitro-resultater . Derimod blev der observeret antiinflammatorisk aktivitet af AME i serumresponset af TNF-α og IL-6 ved intraperitoneal injektion af LPS. Denne systemiske antiinflammatoriske aktivitet er mindst sandsynligt, at den er formidlet af modulering af makrofager. En af forskellene mellem in vivo- og in vitro-forholdene er, at LPS transporteres i kredsløbet af flere lipoproteiner og derefter cleares af hepatocytter in vivo, hvorimod denne begivenhed ikke kan efterlignes in vitro . LPS-clearance kan forhindre overstimulering af levermakrofager . Det er endnu uvist, om AME’s systemiske antiinflammatoriske aktivitet er relateret til LPS-clearance i leveren. Et lignende resultat blev opnået i peritoneale makrofager isoleret fra mus, der fik oral Astragalus membranaceus-vandekstrakt (upublicerede data). Astragalus membranaceus og AM tilhører den samme kategori af Qi-tonificerende urter. På nuværende tidspunkt ved vi ikke, om den antiinflammatoriske aktivitet in vivo, der ikke involverer makrofagmodulation, er unik for disse lægeplanter eller en fælles egenskab, der kan induceres af Qi-tonificerende lægeplanter, og vi har brug for at samle flere data for at drage konklusioner. Desuden rapporterede Li et al., at atractylenolid I og 14-acetoxy-12-senecioyloxytetradeca-2E,8E,10E-trien-4,6-diyn-1-ol, en type polyacetylenforbindelse isoleret fra AM, har en molekylær struktur, der interagerer med membranbunden glukokortikoidreceptor . Ifølge deres undersøgelse var 300 mg/kg oral atractylenolid I og 30 mg/kg oral polyacetylen de minimumsdoser, der var nødvendige for at vise antiinflammatoriske virkninger . Mængden af atractylenolid I i 2 500 mg/kg AME er blot 0,097 mg/kg, hvilket er en dosis langt under den krævede minimumsdosis. Desuden må der være sket et tab af polyacetylener under fremstillingen af AME. Det er muligt, at AME indeholder uidentificerede glukokortikoidlignende forbindelser, der bidrager til dets systemiske antiinflammatoriske aktivitet.

Det er nødvendigt med et tilstrækkeligt antal T-celler for at opretholde et korrekt immunrespons. Under normale forhold opretholdes det samlede antal T-celler ved dannelsen af naive T-celler i thymus og omsætningen af perifere naive T-celler og hukommelses-T-celler. Mus og mennesker gennemgår thymusatrofi med alderen, og derfor falder produktionen af naive T-celler hos begge arter . Med hensyn til vedligeholdelse af naive T-celler producerer mus imidlertid naive T-celler i løbet af deres levetid, mens voksne mennesker vedligeholder denne population ved at dele perifere naive T-celler . Desuden er levetiden for musenes naive T-celler 40 gange kortere end deres menneskelige modstykker . Hukommelses-T-celler vedligeholdes ved intermitterende deling . Den præcise overlevelses- og homeostatiske proliferationsmekanisme for naive T-celler og hukommelses-T-celler er ikke helt defineret, men involverer signaler fra TCR/MHC-komplekset og cytokiner som IL-7 og IL-15 . Den langvarige virkning af vacciner afhænger af hukommelses-T-celler, mens behandling af lymfopeniske tilstande kræver naive T-celler. Vi har ikke bestemt, om den miltære CD4 T-cellepopulation, der steg ved AME-behandling, bestod af naive CD4 T-celler eller memory CD4 T-celler. En detaljeret karakterisering af den cellefraktion, der reagerer på AME, vil bidrage til at specificere, hvilken situation der er bedre egnet til anvendelse af AME.

Det skal bemærkes, at der samtidig skete en opregulering af MHC-klasse II-molekyler i milten i AME-gruppen. MHC klasse II-molekyler er nødvendige for at levere antigener til CD4 T-celler. Vi fandt rutinemæssigt, at størstedelen af MHC-klasse II-udtrykkende celler i milten er B-celler, og at de resterende celler er makrofager og dendritiske celler. Vi har ikke afklaret, hvilke celletyper der viste opregulering af MHC-klasse II-molekyler efter AME-administration. Ikke desto mindre tyder stigninger i både antallet af CD4 T-celler og ekspression af MHC klasse II-molekylet i milten på, at tilskud af AME bidrager til den systemiske vedligeholdelse af CD4 T-celler. IL-4 har under fysiologiske forhold til opgave at øge antistofresponset ved at fremme overlevelse og proliferation af B-celler og yde forsvar mod helminth-infektioner . Splenocytter fra AME-grupperne viste øget IL-4-produktion under T-celleaktivering ex vivo samtidig med nedsat IFN-γ-produktion. Disse resultater tyder på, at AME under normale forhold fremmer Th2-responset. I modsætning hertil fremmer oral indgivelse af AM-afledt glycoprotein Th1-responset, mens Th2-responset mindskes i en allergisk model . Det er ikke klart, om denne forbindelse repræsenterer hele AM’s aktivitet. Der er behov for yderligere undersøgelser for at fastslå, om AME forhindrer eller forværrer patologiske Th2-responser.

5. Konklusion

I denne undersøgelse observerede vi ændringer i reaktionerne hos makrofager og T-celler i normale mus efter oral indgivelse af AME. AME forbedrede thioglycollat-induceret monocytdifferentiering i peritoneum og undertrykte LPS-inducerede TNF-α- og IL-6-niveauer i serum. I modsætning til disse systemiske antiinflammatoriske virkninger var antiinflammatoriske virkninger ikke tydelige i makrofager isoleret fra AME-gruppen, bortset fra ændringer i ekspressionen af kostimulerende molekyler. AME påvirkede også det adaptive immunsystem ved at øge antallet af CD4 T-celler og ekspressionen af MHC-klasse II-molekyler og ved at fremme Th2-responset frem for Th1-responset.

Abkortninger

Databesiddelse

De data, der er anvendt til at understøtte resultaterne af denne undersøgelse, er tilgængelige fra den tilsvarende forfatter på anmodning.

Interessekonflikter

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.

Akkreditering

Denne forskning blev støttet af Basic Science Research Program gennem National Research Foundation of Korea finansieret af Undervisningsministeriet (2014R1A1A2055052).