I denne undersøgelse undersøgte vi effekten af en akut intravenøs volumenbelastning på 0.9% saltvand, 3% saltvand og isotonisk glukoseinfusioner på u-AQP2 og u-ENaCγ i en randomiseret, cross-over undersøgelse af raske forsøgspersoner. Formålet var at evaluere transportaktiviteten via aquaporin 2-vandkanalerne og de epitheliale natriumkanaler i hovedcellerne i den distale del af nefronet.
Under infusionen og i perioden umiddelbart efter finder der adaptive fysiologiske ændringer sted i nyrefunktionen og vasoaktive hormoner. De vigtigste ændringer i effektvariablerne kunne således forventes at indtræffe efter infusionen. I den foreliggende undersøgelse var vi særligt opmærksomme på ændringer i effektvariablerne i den sidste periode efter infusionen (Post infusion 210-240), dvs. 60-90 minutter efter, at infusionen var ophørt. I denne periode steg u-AQP2 efter hypertonisk og isotonisk saltvandsinfusion og faldt efter glucoseinfusion. Samtidig steg u-ENaCγ efter hypertonisk saltvandsinfusion og forblev uændret efter isotonisk saltvands- og glucoseinfusion.
U-AQP2 efter infusion med hypotonisk og isotonisk saltvand og isotonisk glucose
Aquaporin-2 (AQP2) er placeret i collecting ductus principal-cellerne og udtrykkes i den apikale plasmamembran . Vasopressin (AVP) regulerer AQP2 ved at binde sig til V2-receptorer i den basolaterale membran, . Kortvarig eksponering for AVP forårsager trafikering og indsættelse af de intracellulære vesikler, der indeholder AQP2, til den apikale membran og øger vandpermeabiliteten og absorptionen . Langtidsregulering sker over en periode på timer til dage og skyldes AVP-reguleret gentranskription, der resulterer i en forøgelse af AQP2-indholdet i hele cellen . Forsøg på rotter viste, at infusion af dDAVP øgede u-AQP2 . Dette er i overensstemmelse med det synspunkt, at øget levering af AQP2-kanaler til den apikale membran resulterer i øget udskillelse af AQP2 efter stimulering med AVP . Ca. 3% af AQP2 i samleleddet udskilles i urinen , men de underliggende mekanismer er ukendte.
Volumeudvidelse med 3% hypertonisk saltvand øger plasma osmolariteten over tærsklen for de hypothalamiske osmoreceptorer, hvilket udløser frigivelse af AVP og en efterfølgende stigning i u-AQP2. Saito et al fandt en signifikant sammenhæng mellem urinudskillelse af AQP2 og p-AVP hos raske personer efter 5% hypertonisk saltvandsinfusion . Pedersen et al fandt en positiv korrelation mellem u-AQP2 og p-AVP under 24 timers vandmangel og efter 3% hypertonisk saltvandsinfusion . Tidligere undersøgelser på mennesker har således vist, at aktiviteten af AQP2-vandkanalerne kan bestemmes ved at måle u-AQP2 . Overraskende nok fandt Baumgartner et al ingen ændring i u-AQP2 efter infusion af 2,5% NaCl hos raske frivillige på trods af en betydelig stigning i både urinosmolaritet og AVP . Imidlertid var den orale vandbelastning 3-4 gange højere før infusionen sammenlignet med vores undersøgelse. Således kan den store vandbelastning før infusionen have tilsidesat de stimulerende virkninger af hypertonisk saltvand. Som forventet viste vores undersøgelse, at u-AQP2 steg efter 3% NaCl med en tilsvarende stigning i urinosmolariteten og et fald i CH2O. Vores resultater tyder således på en øget vandreabsorption via aquaporin-2-vandkanalerne i de distale tubuli. Forud for stigningen i u-AQP2 var der en pludselig stigning i p-osm og p-AVP induceret af den hypertoniske saltvandsinfusion. Dyreforsøg har vist, at hypertonicitet kan forårsage en opregulering af AQP2-ekspressionen i den apikale membran, der kan sammenlignes med den, der opnås ved AVP alene . Det kan ikke udelukkes, at dette kan spille en aktiv rolle i den øgede udskillelse af u-AQP2. Det mest sandsynlige er, at den øgede vandreabsorption blev formidlet af en stigning i p-AVP. U-AQP2 fortsatte med at stige i løbet af hele undersøgelsesdagen, hvilket tyder på, at AQP2-kanalerne forblev indsat og aktive i den apikale membran på grund af virkningerne af forhøjet p-AVP.
Infusion af isotonisk saltvand nedtrykker den fraktionelle vand- og saltreabsorption i de proximale tubuli hos dyr . I den foreliggende undersøgelse forårsagede infusion med 0,9% NaCl den samme reaktion i u-AQP2, u-osm og CH2O som 3% NaCl-infusion, om end i mindre grad. Der var en lille stigning i p-osm til et maksimalt niveau på 286 mosmol/kg svarende til en stigning på 0,5%. Denne stigning ligger under osmoreceptortærsklen, og vi hverken så eller forventede nogen væsentlig ændring i p-AVP. Derfor kunne AVP ikke være den vigtigste regulator af AQP2 under 0,9 % NaCl. Det mest sandsynlige er, at den øgede vandtransport via AQP2 er et kompenserende fænomen for at modvirke et fald i den renale vandabsorption i de proximale tubuli, som opstår efter isotonisk volumenudvidelse. Mekanismen kan skyldes en øget aktivitet i det natriuretiske peptidsystem .
Infusion af 5 % glukose forårsager en volumenekspansion fordelt på alle væskefaser i kroppen med kun en meget lille stigning i plasmavolumen. Dette illustreres i målingerne af plasmaalbumin, hvor koncentrationerne ved 240 min. stort set var lig med baseline (tabel 4), hvilket indikerer ingen ændring i den ekstracellulære væske. Så vidt vi ved, har ingen undersøgelse målt u-AQP2 efter glucoseinfusion. En undersøgelse af raske personer viste, at efter en oral vandbelastning på 20 ml/kg i 15 minutter (gennemsnitligt indtag 1605 ml) faldt u-AQP2 med 17 % efter 210 minutter . I en nyere undersøgelse fik forsøgspersoner en oral vandbelastning på 20 ml/kg i 15 minutter (gennemsnitligt indtag 1389 ml) med et efterfølgende fald på 27 % i u-AQP2 efter 240 minutter . Både plasma osmolaritet og p-AVP faldt. Det er således blevet vist, at u-AQP2 reduceres under vanddiurese efter oral vandindtagelse .
I vores undersøgelse fik forsøgspersonerne i gennemsnit 1736 ml glukose IV. I den sidste post-infusionsperiode indtraf det forventede aquaretiske respons med et fald på 16 % i u-AQP2cr, et fald i u-osm og en stigning i UO og CH2O. Plasmaosmolariteten faldt fra 285 mosm/kg til 280 m0sm/kg, dvs. et fald på 2 %, men uden nogen ledsagende reduktion i p-AVP. Vores resultater tyder på en reduceret reabsorption af vand via aquaporin-2-vandkanalerne i de distale tubuli efter isotonisk glukoseinfusion. Den manglende ændring i p-AVP kunne for det første forklares ved, at forsøgspersonerne havde fået 1225 ml oral vandbelastning før infusionens start, og dette kunne have undertrykt AVP i baselineperioderne forinden. For det andet er målingerne af p-AVP-koncentrationen måske ikke følsomme nok til at påvise et lille fald. Det peptid Apelin, der for nylig blev opdaget, kan også spille en rolle. Apelin er kolozaliseret med AVP i magnocellulære neuroner i hypothalamus . Hos raske mandlige frivillige forsøgspersoner reducerede en nedsættelse af plasmaosmolariteten ved vandbelastning p-AVP beskedent, men p-Apelin steg hurtigt . Apelin-regulering er modsat AVP’s, og data tyder på, at Apelin ligesom AVP kan deltage i reguleringen af vandhomeostase . Vi målte ikke p-Apelin, men det kunne have været interessant at undersøge plasmaapelin parallelt med p-AVP under forhold med forskellige volumenudvidelser.
Så i den sidste post-infusionsperiode steg u-AQP2 omtrent i samme omfang efter hypertonisk og isotonisk saltvandsinfusion, mens der blev set et markant fald efter isotonisk glukoseinfusion. En mulig forklaring på forsinkelsen i ændringerne af u-AQP2 kunne være, at det tager få minutter for ændringer i AVP at virke på hovedcellen, enten ved indsættelse eller fjernelse af AQP2 fra den apikale membran, men at det tager flere minutter, før effekten ses i udskillelsen af u-AQP2 i urinen.
U-ENaCγ efter infusion med hypotonisk og isotonisk saltvand og isotonisk glukose
Natriumtransport gennem samlekanalen sker gennem den epitheliale natriumkanal og er ansvarlig for reabsorption af 3-5 % af det filtrerede natrium . ENaC består af tre forskellige underenheder: α, β og γ og er lokaliseret ved den apikale plasmamembran i hovedcellerne . ENaC er et mål for aldosteron, der virker på mineralokortikoidreceptoren. Aldosteron øger natriumtransporten ved at omfordele ENaC-underenheder fra intracellulære placeringer til den apikale membran samt ved at ændre gentranskriptionen . Mens virkningen af aldosteron sker over timer eller dage, involverer en anden synergistisk vej AVP . I de kortikale opsamlingsgange hos rotter binder AVP til V2-receptorerne, stimulerer cAMP og øger natriumreabsorptionen ved at fremme trafikken og indsættelsen af ENaC i den apikale membran, hvilket medfører en hurtig ændring i kanalaktiviteten . Nylige undersøgelser på mennesker viste, at AVP via V2-receptorer stimulerer ENaC-medieret natriumreabsorption gennem hovedceller .
Fraktioner af ENaC udskilles normalt i urinen. Mængden af ENaC-fraktioner formodes at afspejle aktiviteten af natriumtransporten via de epitheliale natriumkanaler, ligesom u-AQP2 afspejler den funktionelle status af AQP2-vandkanalerne. For nylig introducerede vores gruppe en ny metode til at evaluere natriumreabsorptionen i de vigtigste celler i de distale tubuli. Lauridsen et al. påviste en signifikant korrelation mellem ændringer i urinudskillelse af natrium og ændringer i urinudskillelse af beta-fraktionen (u-ENaCβ) hos raske mennesker . Tilsyneladende kan u-ENaCβ anvendes som en biomarkør for transport af natrium via ENaC. I den foreliggende undersøgelse målte vi gammafraktionen af proteinet af de epiteliale natriumkanaler for at evaluere op- og nedregulering af γ-ENaC-ekspression og natriumtransport via ENaC som tidligere rapporteret fra vores gruppe .
Natrium-chlorid-symporteren (NCC) i de distale konvoluterede tubuli (DCT) er som en anden vigtig natriumreabsorberende vej. Natriumreabsorption i DCT er afgørende for at definere mængden af natriumtilførsel til de vigtigste celler i samlekanalen. Det er almindeligt anerkendt, at NCC reguleres af Ang II og aldosteron . Undersøgelser har også vist, at højt AVP øger fosforyleringen af NCC og formodentlig resulterer i større natriumreabsorption .
Eksperimentelle dyreforsøg har vist, at isotonisk og hypertonisk saltvand IV reducerede reabsorptionen af natrium i de proximale tubuli og dermed øgede mængden af natrium i urinen . Andersen LJ et al. undersøgte virkningerne af hypertonisk og isotonisk saltvand hos raske forsøgspersoner på en kontrolleret diæt. Forsøgspersonerne fik en IV-natriumbelastning på enten 25 ml/kg isotonisk saltvand eller 4,5 ml/kg 3% hypertonisk saltvand i 90 minutter . Udskillelsen af natrium i urinen steg med både isotonisk og hypertonisk saltvand, idet natriurese efter hypertonisk saltvand var større end efter isotonisk saltvand. Plasmanatrium og plasmaosmolaritet steg betydeligt efter hypertonisk saltvand, og det samme gjorde p-AVP. Vores undersøgelse viste, at 3% NaCl-infusion øgede u-ENaCγ, FENa, p-Osm, p-Na og p-AVP. Vores resultater afspejler således en øget natriumreabsorption via ENaC i de vigtigste celler og bekræfter desuden resultaterne fra Andersen et al . Den øgede u-ENaCγ kunne delvist forklares ved et betydeligt fald i den renale natriumabsorption proximalt i nefronet, som kompenseres og justeres af en øget absorption i den distale del. Den stigning i p-AVP, der blev set umiddelbart efter 3% NaCl-infusionen, kunne imidlertid også indikere, at den øgede u-ENaCγ er forårsaget af virkninger af AVP. En øget natriumbevægelse fra lumen til cellen via ENaC ville teoretisk set drive kaliumsekretion gennem ROMK-kanalerne . Overraskende nok målte vi et fald i udskillelsen af kalium i urinen. Dette kunne tale imod en vigtig rolle for ENaC-medieret natriumtransport. Hvis NCC øgede natriumreabsorptionen, både for at kompensere for et fald i den proximale reabsorption og på grund af høj p-AVP, ville mindre natrium blive transporteret af ENaC, og der ville således ikke finde kaliumsekretion sted. En eventuel rolle for NCC efter infusion med hypertonisk saltvand er rent spekulativ, da vi ikke målte NCC’s aktivitet. Måske så vi ikke den positive effekt på kaliumsekretionen inden for vores tidsgrænser. Kaliumtransporten er imidlertid kompleks, og der er mange faktorer, der modulerer kaliumtransporten, såsom ændret tubulært flow og aldosteron.
Efter volumenudvidelse med isotonisk saltvand reduceres det onkotiske tryk en smule, hvilket fører til en umiddelbar stigning i GFR og mindre reabsorption af vand i den proximale tubulus. Vi målte en lille stigning i GFR og UO-output. Natriumudskillelsen steg, men u-ENaCγ, p-Na, p-osm og p-AVP forblev uændret, og resultaterne var således som vi forventede. Med hensyn til NCC ville man ikke forvente nogen ændring i NCC-medieret natriumreabsorption under isotonisk saltvand.
Ingen undersøgelse har nogensinde evalueret u-ENaCγ under vanddiurese. I vores undersøgelse målte vi en tendens til en reduktion i u-ENaCγ efter glucoseinfusion, hvilket afspejler en lille reduktion af natriumreabsorption via ENaC i hovedcellen. Som tidligere nævnt målte vi et fald på 2 % i p-osmolalitet efter glucoseinfusion, hvilket teoretisk set burde udløse et fald i AVP. Vi påviste ikke et fald i p-AVP, hvilket formentlig skyldes et lavt p-AVP forårsaget af oral vandbelastning i forvejen eller det faktum, at målingerne af p-AVP-koncentrationen måske ikke er følsomme nok til at påvise små ændringer. Det kunne være en hypotese, at faldet i u-ENaCγ kunne skyldes manglende AVP-binding til V2-receptorer i den basolaterale membran i hovedcellen. Manglende AVP-stimuli fører til en øget endocytose af ENaC-kanaler fra membranoverfladen til genbrugsvesikler, derved mindskes reabsorptionen af natrium .
Så i den sidste postinfusionsperiode steg u-ENaCγ markant efter hypertonisk saltvandsinfusion, var omtrent på samme niveau efter isotonisk saltvandsinfusion og faldt eller havde tendens til at falde som reaktion på glucoseinfusion. Stigningen i p-osm og p-AVP blev set umiddelbart efter ophør af 3% NaCl-infusionen. Forsinkelsen og det konstante niveau af u-ENaCγ efter hypertonisk saltvand kunne forklares ved, at det tager få minutter at øge trafikken af intracellulære depoter af ENaC-kanaler til den apikale membran, men adskillige minutter at udskille ENaC i urinen efter stimulering med AVP.
Vasoaktive hormoner
Ud over AVP er renin-angiotensin-aldosteron-systemet (RAAS) en vigtig regulator af den renale natriumudskillelse og dermed af kroppens væskevolumen. Det er velkendt, at natriumdepletion aktiverer og at kronisk natriumbelastning reducerer RAAS . In vitro- og in vivo-undersøgelser har vist, at aldosteron stimulerer mineralokortikoidreceptoren til en øget transkription af gener, der koder for proteiner involveret i natriumtransport, dvs. ENaC og Na,K-ATPase .
Numre undersøgelser af ændringer i blodvolumen har vist, at akutte ændringer er forbundet med omvendte justeringer af renin-angiotensin-aldosteron-systemet . I den foreliggende undersøgelse resulterede volumenudvidelse med 3 % og 0,9 % saltvand i en lignende og signifikant reduktion af PRC, p-AngII og Aldo i overensstemmelse med en stigning i det ekstracellulære volumen. Dette er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser .
Efter glukoseinfusion målte vi ingen signifikant ændring i PRC, p-AngII eller p-Aldo. Dette var forventet, da glukoseinfusion ikke medfører nogen markant ændring i det ekstracellulære volumen. Vores undersøgelse var ikke designet til at tillade eventuelle regulerende virkninger af aldosteron, da virkningen af aldosteron sker over timer eller dage. Derfor må andre faktorer være impliceret i reguleringen af ENaC.
Styrker og begrænsninger
Den største styrke ved denne undersøgelse var designet som en randomiseret crossover-undersøgelse med en homogen gruppe af raske unge mænd og kvinder. Forsøgsbetingelserne var meget veldefinerede med hensyn til kost, natrium- og væskeindtag. Resultaterne er således ikke forvirret af forskellig salt- eller vandbalance. I denne undersøgelse blev kun de akutte virkninger af volumenudvidelse undersøgt. Vi kunne uden tvivl have fået flere oplysninger om de langsigtede virkninger af volumenudvidelse og urinudskillelsen af AQP2 og ENaCγ, hvis perioden efter infusionen havde været længere. Desuden var undersøgelsen ikke placebokontrolleret ved hjælp af infusion med en ubetydelig mængde 0,9 % saltvand. Dette kunne have skelnet virkningerne af volumenudvidelse fra den generelle variabilitet i vand- og saltreabsorptionen. I denne undersøgelse var det ikke muligt at foretage ANP-målinger. Det kunne have givet et positivt bidrag til vores resultater.