Resultater
Effektiv biotinylering af mærkede GATA-1 i transficerede celler. Skemaet for specifik in vivo biotinylering af mærkede proteiner i pattedyrceller er skitseret i fig. 1A. I henhold til denne procedure fusioneres et lille (23 aa) peptidtag til det pågældende protein og sameksprimeres i celler sammen med BirA, en bakteriel protein-biotinligase (20). Det anvendte peptidtag er tidligere blevet isoleret fra et syntetisk peptidbibliotek, der er screenet for BirA-medieret biotinylering, som sker specifikt ved lysinrester i tagget (16). Søgninger i proteindatabaser har ikke identificeret nogen naturligt forekommende proteiner, som har et sekvensmotiv, der ligner peptidtagets.
(A) Skema for specifik biotinylering af mærket GATA-1 ved hjælp af BirA-biotinligase i MEL-celler. Sekvensen af det 23-aa peptidtag, der er fused til GATA-1’s N-terminus, er vist. Asterisken angiver den lysinrest, der bliver specifikt biotinyleret af BirA. De prikkede felter angiver positionerne for de to GATA-1-zinkfingre. Tagged GATA-1 og BirA blev klonet hver for sig i en pattedyrs erytroide ekspressionskassette og coeksprimeret i MEL-celler. (B) Biotinylering af mærket GATA-1 i MEL-celler. (Til venstre) Western blot med et anti-GATA-1-antistof til påvisning af endogene og mærkede GATA-1-proteiner. (Højre) Western blot af de samme ekstrakter med streptavidin-HRP-konjugat for at påvise biotinyleret GATA-1. Kerneekstrakter (5 μg pr. vognbane) fra dobbelttransfektanterne (vognbane 1 og 5) og enkelttransfektanterne (vognbane 2, 3, 6 og 7) for mærket GATA-1 og Bir A blev testet. Linje 4 og 8, kerneekstrakt fra ikke-transficerede MEL-celler. Biotinyleret GATA-1 (asterisk) er kun tydeligt synligt i den eneste vognbane for de dobbelt transficerede celler. Det er også angivet den lave baggrund, der påvises af streptavidin i MEL-kerneekstrakter fra celler, der kun udtrykker BirA (til højre, bane 7). (C) Effektivitet af GATA-1-biotinylering og binding til streptavidinkugler. (Til venstre) Western blot med anti-GATA-1-antistof til påvisning af binding af mærket GATA-1 til streptavidinperler (lane 2; startmateriale til bindingen var 2,5 gange mængden af kerneekstrakt vist i indgangslane). Indgangsmateriale og ubundet materiale er vist i lanes 1 og 3. (Til højre) Det samme filter strippet og reprobed med streptavidin-HRP til påvisning af bindingen af biotinyleret GATA-1 til streptavidinperler (lane 5). Lane 6 viser, at meget lidt mærket GATA-1 forbliver ubundet af streptavidin. I dette bindingseksperiment blev perlerne vasket under strenge forhold (0,5 M NaCl/0,3 % Triton X-100 i PBS). In, input (kerneekstrakt); El, elueret materiale; Un, ubundet materiale.
Det protein, vi mærkede ved afprøvning af dette system, var den essentielle murine hæmatopoietiske transkriptionsfaktor GATA-1 (for gennemgang, se ref. 25). Tagget blev fusioneret N-terminalt til GATA-1 og udtrykt under kontrol af en human β-globin-ekspressionskassette i MEL-celler, som kan induceres til at gennemgå terminal erytroide celledifferentiering (22). BirA blev også klonet og udtrykt i MEL-celler ved hjælp af den humane globinekspressionskassette. Kloner svarende til enkelt- og dobbelte stabile transfectanter for mærkede GATA-1- og BirA-konstruktioner blev isoleret og indledningsvis screenet for ekspression af begge konstruktioner. For GATA-1’s vedkommende påviste Western Blot-analyse med et GATA-1-antistof det langsomt migrerende mærkede protein samt det endogene GATA-1 i kerneekstrakter fra transficerede celler (fig. 1B, spor 1 og 2). Ekspression af BirA blev analyseret på RNA-niveau (data ikke vist).
Vi testede derefter på udvalgte stabile transfektanter, om det mærkede GATA-1-protein blev biotinyleret af BirA. Analysering af kerneekstrakter fra MEL-cellekloner ved hjælp af et streptavidin-HRP-konjugat viste et robust signal svarende til det mærkede GATA-1-protein, der kun kunne påvises i banen for den mærkede GATA-1/BirA-dobbelttransfektant (Fig. 1B, bane 5). Ingen biotinylering af mærket GATA-1 er synlig i fravær af BirA (fig. 1B, vognbane 6). Disse resultater bekræfter, at BirA-proteinet syntetiseres i en aktiv form i transficerede MEL-celler. Desuden observeres der meget lidt uspecifik baggrundsbiotinylering i MEL-cellekerneekstrakter, der kun udtrykker BirA (fig. 1B, bane 7). Vi konkluderer derfor, at ekspression af bakteriel BirA-protein-biotinligase i MEL-celler specifikt kan biotinylering af en pattedyrs transkriptionsfaktor med et unikt peptidtag.
Vi testede derefter effektiviteten af biotinylering ved at binde tagget GATA-1 i rå kerneekstrakter til streptavidin paramagnetiske Dynabeads (Fig. 1C). Analyse af det materiale, der blev elueret fra perlerne, viste, at næsten hele det mærkede GATA-1-protein blev bundet (sammenlign lane 2 med lane 1 og 3, Fig. 1C). Gentagelse af det samme filter med streptavidin-HRP viser ≈100 % effektivitet i biotinylering og indfangning af mærket GATA-1 af perlerne (Fig. 1C, baner 4 og 5). Desuden er der, i overensstemmelse med det, der blev set i fig. 1B, kun en lille baggrundsbinding af endogent biotinylerede proteiner til perlerne, som detekteret med streptavidin-HRP (fig. 1C, bane 5). Disse data viser, at mærket GATA-1 biotinyleres meget effektivt og genfindes fra ekstrakter ved streptavidinbinding med ubetydelig baggrundsbiotinylering.
Einstrenget oprensning af biotinyleret GATA-1 fra rå nukleare ekstrakter ved streptavidinbinding. Vi undersøgte også gennemførligheden af en enkelttrinsoprensning til isolering af biotinyleret GATA-1 fra rå kerneekstrakter ved direkte binding til streptavidinperler under moderat stringens (150 mM NaCl/0,3 % Nonidet P-40/200 ng/μl kyllingeserumalbumin). Vi prøvede først en kontrolbinding fra 5 mg rå kerneekstrakter fra MEL-celler, der kun udtrykker BirA (fig. 2, bane 4). Det eluerede materiale bestod af ca. fem stærkt farvede bånd på baggrund af en baggrund af meget svagere bånd (Fig. 2, lane 5). Vi identificerede de baggrundsbindende proteiner ved at udskille hele banen fra gelen og analysere den ved væskekromatografi-tandem MS. De således identificerede proteiner er klassificeret i tabel 1 i henhold til biologisk funktion og cellulært rum, som defineret af Gene Ontology Consortium (www.geneontology.org). Resultaterne viste, at de mest hyppige baggrundsproteiner, der blev identificeret, var de naturligt biotinylerede carboxylaser og tilknyttede enzymer, som i vid udstrækning faldt sammen med de intenst farvende bånd. Vi fandt også baggrundsbinding af rigelige nukleare proteiner, der er involveret i mRNA-processering, f.eks. splejsefaktorer, samt af ribosomale proteiner. Tilsammen tegnede disse tre klasser af proteiner sig for >80% af baggrundsbindingen under de anvendte betingelser (tabel 1). Det er bemærkelsesværdigt, at meget få peptider blev identificeret som svarende til faktorer, der er involveret i transkriptionel regulering (tabel 1). Vi konkluderer, at baggrundsbinding til streptavidinperler hovedsagelig skyldes endogene biotinylerede proteiner samt rigelige nukleare faktorer, der er involveret i mRNA-processering og ribosomsyntese og -samling, med meget lidt uspecifik binding af faktorer, der er involveret i transkriptionel regulering/aktivering.
Colloidalblåfarvet gel af et bindingseksperiment af rå kerneekstrakter til streptavidinperler. Lane 1, markør (M). Lane 2, inputkerneekstrakt fra mærkede GATA-1/BirA-dobbelttransficerede celler (≈12 μg). Lane 3, eluerede proteiner efter direkte binding til streptavidinperler af ≈5 mg rå kerneekstrakter fra mærkede GATA-1/BirA-transficerede celler. Lane 4, inputkerneekstrakt fra mærkede GATA-1/BirA-transficerede celler. Lane 5, proteiner, der er elueret efter binding til streptavidinperler af ≈5 mg kerneekstrakt fra BirA-transficerede celler. Pil i lane 3 angiver proteinbånd, der indeholder oprenset biotinyleret GATA-1, som bestemt ved MS.
- Se inline
- Se popup
Vi prøvede derefter at binde en tilsvarende mængde rå kerneekstrakt (5 mg) fra mærkede GATA-1/BirA-dobbelttransfektanter under de samme betingelser (Fig. 2, bane 2). Farvningsmønsteret i vognbanen med det eluerede materiale (Fig. 2, vognbane 3) var signifikant forskelligt fra det, der blev observeret med baggrundsbindingen i vognbane 5, hvilket indikerer en betydelig berigelse af proteiner, der coelererer med mærket GATA-1 (Fig. 2, vognbane 3 vs. vognbane 5). Biotinyleret GATA-1 og coeluting-proteiner kan fortynde ud eller konkurrere om binding med de uspecifikke proteiner, der observeres i vognbane 5. Den proteinberigelse, der er synlig i vognbane 3, kan således svare til samurificerede GATA-1-interagerende proteiner. I det eluerede materiale observerede vi også et stærkt farvet bånd, der migrerede med en størrelse svarende til den forventede størrelse for mærket GATA-1 (fig. 2, pil, vognbane 3). Vi bekræftede tilstedeværelsen af GATA-1 i dette bånd ved geludskæring og MS. Den detaljerede analyse af alle proteiner, der copurificerer med mærket GATA-1, vil blive offentliggjort andetsteds (P.R., F.G. og J.S., upublicerede resultater). Samlet set demonstrerer disse data den kvantitative biotinylering af mærket GATA-1 i MEL-celler og dens effektive oprensning fra råproteinekstrakter i en enkelttrinsprocedure ved direkte binding til streptavidinperler med få baggrundsbindingsbånd, der primært svarer til endogent biotinylerede proteiner og let identificerbare rigelige nukleare/nucleolære proteiner.
Biotinylering påvirker ikke GATA-1’s proteininteragerende eller DNA-bindingsegenskaber. Da det er muligt, at tilføjelse af peptidmærket og/eller biotinylering kan påvirke egenskaberne af det mærkede protein, testede vi, om biotinyleret GATA-1 stadig kunne gennemgå protein-protein-interaktioner med en kendt GATA-1-partner, såsom FOG-1 (26), og om det kunne binde in vivo til kendte GATA-1-genmål, såsom mus βmaj globinpromotor. Vi udførte et pull-down-forsøg med biotinyleret GATA-1 ved at binde kerneekstrakter til streptavidinperler og testede, om FOG-1 også blev copurificeret. Vi fandt, at FOG-1 blev trukket ned fra ekstrakter, der udtrykker biotinyleret GATA-1, men ikke fra ekstrakter, der kun udtrykker BirA (fig. 3A, spor 2 og 4). Vi har også fundet, at FOG-1 copurificerede med biotinyleret GATA-1 ved MS. Vi udførte også et kromatin pull-down (ChIP)-eksperiment, hvor soniceret kromatin fra formaldehyd-krydsede MEL-celler blev inkuberet med streptavidinperler, efterfulgt af eluering af det bundne materiale og genvinding af det pull-down DNA. Ved hjælp af primere, der er specifikke for βmaj-promotoren, fandt vi en berigelse for disse sekvenser i det DNA, der blev trukket ned fra kromatinet fra celler, der udtrykker biotinyleret GATA-1, men ikke fra celler, der udtrykker BirA (Fig. 3B). Vi har også fundet, at biotinylering ikke påvirker den subnukleære fordeling, der normalt observeres med GATA-1 (Fig. 5, som er offentliggjort som støtteinformation på PNAS-webstedet; ref. 27), og at biotinyleret GATA-1 viser en identisk biokemisk fraktioneringsprofil som endogent GATA-1 i MEL-cellekerneekstrakter (data ikke vist). Samlet set giver disse resultater stærke beviser for, at GATA-1’s egenskaber ikke påvirkes af biotinyleringsmærkning. Desuden viser disse data også anvendelsen af biotinyleringsmærkning som et alternativ til antistoffer i metoder, der involverer et affinitetsrensningstrin, såsom protein pull-downs eller en ChIP-assay.
(A) Binding af biotinyleret GATA-1 til streptavidinperler trækker specifikt FOG-1 ned, som detekteret ved Western Blotting ved hjælp af et FOG-1-antistof. I modsætning hertil kan FOG-1 ikke trækkes ned af streptavidin i kerneekstrakter, der kun udtrykker biotinyleret udtrykker BirA (til højre). FOG-1 påvises som en doublet (26). (B) Streptavidin pull-down af βmaj globinpromotorsekvenser fra krydsbundet kromatin fra MEL-celler, der udtrykker biotinyleret GATA-1 (venstre) eller kun BirA (højre). Trekanterne angiver stigende mængder pull-down tværbunden kromatin, der anvendes som skabelon i PCR-reaktioner til påvisning af amplifikation af βmaj-sekvenserne. Der observeres specifik berigelse for βmaj-sekvenser i pulled-down-kromatin fra celler, der udtrykker biotinyleret GATA-1, men ikke fra celler, der kun udtrykker BirA.
Biotinyleringsmærkning i transgene mus. Evnen til direkte at isolere det biotinmærkede protein fra råekstrakter i et enkelt trin giver mulighed for at anvende denne fremgangsmåde til oprensning af mærket protein fra begrænsende kilder som f.eks. væv fra mus. Vi testede derfor, om BirA-medieret biotinyleringsmærkning også ville fungere in vivo i transgene mus. Da overekspression af GATA-1 fører til embryonisk dødelighed hos mus (28), testede vi denne fremgangsmåde ved at mærke den essentielle erythropoetiske transkriptionsfaktor EKLF (29). Mouse EKLF cDNA blev mærket med biotinyleringsmærket og et dobbelt hæmagglutininin-epitop og mikroinjiceret i museæg for at etablere transgene muselinjer. På samme måde blev der også etableret transgene muselinjer ved mikroinjektion af BirA/erytroide ekspressionskassette-konstruktionen. Transgene muselinjer med påviselig ekspression af mærket EKLF og BirA i erytroide celler blev udvalgt og krydset. In vivo biotinylering af mærket EKLF blev vurderet i kerneekstrakter fremstillet fra fosterlevers fra 13,5-dages postcoitum embryoner. Western blot-analyse med et anti-EKLF-antistof påviste endogent EKLF såvel som mærket EKLF, der blev visualiseret som en doublet (Fig. 4, lane 1). Binding af kernekerneekstrakterne fra føtal lever til streptavidinperler viser, at kun det øverste bånd i doubletten bevares, hvilket tyder på, at det er biotinyleret (Fig. 4, spor 2 og 3). Denne iagttagelse bekræftes ved at undersøge det samme blot med streptavidin-HRP, som kun detekterer et enkelt bånd (fig. 4, spor 7 og 9). Den doublet, der påvises af EKLF-antistoffet, skyldes højst sandsynligt den differentielle udnyttelse af translationsinitieringskodoner ved det N-terminalt fusionerede biotinyleringsmærke (øverste bånd) og ved det dobbelte hæmagglutininepitop, der er til stede umiddelbart nedstrøms, og som også indeholder et initieringskodon (nederste bånd). Som følge heraf er det kun det øverste bånd med biotinyleringsmærket, der tjener som substrat for BirA, hvilket yderligere demonstrerer denne fremgangsmådes in vivo specificitet. Bindingen af kerneekstrakter til streptavidinperler viste også, at en betydelig andel (≈50 %) af mærket EKLF biotinyleres i fosterleberne af transgene mus. Vi spekulerer i, at forskellen i biotinyleringseffektivitet mellem transficerede celler og føtale lever (bortset fra brugen af forskellige fusionsproteiner) kan afspejle en in vivo begrænsning i tilgængeligheden af biotin (biotin er rigeligt til stede i den FCS, der anvendes som supplement til cellekulturmedier) eller en forskel i BirA-ekspressionsniveauet. Disse resultater viser, at den specifikke biotinylering af mærket EKLF med bakteriel BirA også kan opnås med høj effektivitet in vivo i transgene mus.
Specifik biotinylering af mærket EKLF i transgene museembryoner. Kerneekstrakter fra fosterleveren fra 13,5-dages postcoitum-embryoner fra en dobbelt transgen linje med mærket EKLF/BirA (lanes 1-3 og 7-9) og fra en transgen linje med mærket EKLF (lanes 4-6) blev bundet til streptavidinperler. Markeret og biotinyleret EKLF i inputkerneekstrakt, ubundet materiale (sup., supernatant) og bundet materiale blev påvist med et EKLF-antistof (til venstre) eller med streptavidin-HRP (til højre). EKLF-biotinylering og binding til perlerne er kun påvist i ekstrakter fra dobbelt transgene embryoner.