Biofysiker Adam Cohen gik rundt i San Francisco, Californien, i 2010, da han blev overrasket af et telefonopkald. “Vi har et signal,” sagde den, der ringede op. Næsten 5.000 kilometer væk, i Cambridge, Massachusetts, havde hans samarbejdspartnere fundet guldkorn. Efter måneders mislykkede eksperimenter havde forskerne fundet et fluorescerende protein, der gjorde det muligt for dem at se signaler, mens de passerede mellem neuroner.
Men der var noget underligt, der foregik. Da Cohen kom tilbage til sit laboratorium på Harvard University, fandt han ud af, at alle optagelserne fra eksperimentet viste en mærkelig udvikling. Først blinkede neuroner dekoreret med proteinet pænt, når elektriske impulser susede gennem dem. Men så blev cellerne til lyse klatter. “Halvvejs gennem hver optagelse blev signalet helt vildt”, siger Cohen.
Så han besluttede sig for at slutte sig til sit hold under et eksperiment. “Når de startede optagelsen, sad de der og holdt vejret,” siger Cohen. Men så snart det gik op for dem, at det virkede, fejrede de det og “dansede og løb rundt i lokalet”.
I deres overstadighed lod de lyset fra en skrivebordslampe skinne lige ind på mikroskopet. “Vi optog faktisk vores begejstring”, siger Daniel Hochbaum, der dengang var kandidatstuderende i Cohens gruppe. De dæmpede deres jubel, og et år senere offentliggjorde holdet sin undersøgelse1 – en af de første, der viser, at et fluorescerende protein, der er konstrueret i specifikke pattedyrsneuroner, kan bruges til at spore individuelle elektriske impulser i realtid.
Neurovidenskabsfolk har i årtier forsøgt at observere de hurtige elektriske signaler, der er en vigtig del af hjernens sprog. Selv om elektroder, der er arbejdshesten til måling af spænding, pålideligt kan registrere aktiviteten af individuelle neuroner, har de svært ved at opfange signalerne fra mange, især i længerevarende perioder. Men i de seneste to årtier har forskerne fundet en måde at indlejre fluorescerende, spændingsanvisende proteiner direkte i neuronernes cellemembraner. Med den rigtige slags mikroskop kan de så se cellerne lyse op, når de taler med hinanden – hvad enten det er i en hvisken eller i et råb. Med spændingsbilleder kan man også registrere elektrisk snak mellem mange neuroner på én gang og derefter beregne et gennemsnit af disse signaler på tværs af store dele af hjernevævet. Dette hjælper forskerne til at studere hjernens elektriske aktivitet på tværs af forskellige rumlige skalaer ved ikke kun at lytte til de enkelte cellers stemmer, men også til “publikums brølen”, siger Cohen.
I de seneste 5 år har forskerne offentliggjort ca. 1.000 artikler om emnet, og store finansieringsordninger såsom US National Institutes of Health’s BRAIN-initiativ har fremskyndet udviklingen af nye typer af genetisk manipulerede spændingsindikatorer. I håb om at finde bedre varianter har nogle grupper udviklet strategier til at screene millioner af proteiner for ønskede egenskaber som f.eks. lysstyrke. En af disse metoder har identificeret en indikator, der er dobbelt så lysstærk som lignende sensorer, der blev udviklet blot fire år tidligere2.
I takt med at disse proteiner forbedres, og fremskridt inden for mikroskopi gør det lettere at se dem, håber forskerne at kunne belyse neurovidenskabens største gåde: hvordan hjernens celler arbejder sammen om at omdanne et system af elektriske impulser til tanker, handlinger og følelser. Forskerne kæmper stadig for at fange hele spektret af aktivitet og for at udtænke metoder til at se nerver, der affyres hurtigt og dybt inde i hjernevævet. Men hvis fremskridt kan løse disse tekniske udfordringer, “vil det være revolutionerende”, siger Rafael Yuste, der studerer funktionen af neurale kredsløb ved Columbia University i New York.
Højhastighedsproces
Den gennemsnitlige menneskelige hjerne indeholder omkring 120 milliarder neuroner, som konstant modtager og sender information gennem grenlignende vedhæng, der kaldes dendritter. Kemiske eller elektriske signaler, der når frem til dendriterne, skaber små spændingsændringer på tværs af cellemembranen, som ledes videre til cellekroppen. Når summen af spændingsændringerne når et punkt, hvor der ikke er nogen vej tilbage, kaldet en tærskel, affyrer neuronen en stor elektrisk spike – et aktionspotentiale. Dette stød suser med hastigheder på op til 150 meter i sekundet langs en neuronal gren, et såkaldt axon, til et andet sæt af forgrenede vedhæng. Her sender kemiske eller elektriske signaler informationen videre til det næste sæt dendritter.
Neuronale signaler konvergerer, divergerer og synkroniseres for at frembringe en symfoni af tanker, følelser, handlinger og reaktioner, lige fra en rødme i ansigtet til en babys hikke. Men forskernes lytteværktøjer er yderst begrænsede. De første miniatureelektroder, der blev udviklet i 1940’erne, er så tynde som et hår, at de kan indsættes i hjernen, op mod eller inde i neuroner, hvor de måler membranens spænding med præcision og hastighed. Men denne metode kan kun bruges til at overvåge en enkelt eller en håndfuld neuroner ad gangen – og kun i et begrænset tidsrum, fordi elektroderne til sidst beskadiger cellen. Det svarer til at forsøge at få et overblik over et orkesterarrangement ved at følge en enkelt spiller i nogle få sekunder.
Bundter af mikroelektroder kan registrere den elektriske aktivitet i op til 200 celler på én gang, men fordi disse elektroder er placeret tæt på neuronerne i stedet for inde i dem, kan de kun registrere aktionspotentialerne, de skarpeste spikes i den elektriske aktivitet. De er døve over for blødere toner – de små elektriske ændringer, der ikke skubber neuronet hele vejen til et aktionspotentiale. Disse spændingsændringer under tærskelværdien er nøglen til hjernens funktion, fordi de gradvist lægges sammen for at afgøre, om et neuron vil affyre eller ej.
I håbet om at kunne måle mere stille hjerneaktivitet i større populationer af celler begyndte forskere i 1960’erne at lege med tanken om en sensor eller sonde, der fluorescerer som reaktion på et elektrisk signal. De mest populære sonder, kaldet calciumindikatorer, lyser op, når de binder sig til calcium, som strømmer ind i neuronen som følge af en spike i den elektriske aktivitet. Men denne teknik, der er kendt som kalciumafbildning, giver kun en proxy; den registrerer ikke direkte membranspænding. Og selv om den viser signalet fra store begivenheder som f.eks. aktionspotentialer, går den glip af ting, der er afgørende for hjernens funktion, f.eks. subtile udsving i membranens spænding eller de elektriske signaler, der hæmmer aktionspotentialer. Forestil dig, at du kun kan høre et klapsalver efter en symfoni-koncert: Det er klart, at orkestret har spillet, men hvad det spillede, kan man kun gætte sig til.
I 1970’erne begyndte forskerne at udvikle farvesensorer, der direkte registrerer ændringer i membranens spænding. De første versioner af disse farvestoffer skulle males vilkårligt på hjernen, så de mærkede alle celletyper, også ikke-neuronale celler, hvilket gjorde det vanskeligt at skelne aktiviteten af specifikke neuroner.
Derpå begyndte forskerne i 1990’erne at afprøve indikatorer, der kunne manipuleres genetisk til kun at dukke op i de neuroner, der var af interesse. Den første3 genetisk kodede spændingsindikator (GEVI) blev udviklet i 1997, og siden da har forskerne udviklet mere end to dusin sensorer4. Nogle af disse er fremstillet ved at kombinere et spændingsfølsomt protein med fluorescerende molekyler (se “Fluorescensens varianter”). Når disse proteiner registrerer en ændring i spændingen, ændrer de deres 3D-struktur og ændrer fluorescensen af det molekyle, de er koblet til. Andre spændingsindikatorer er muterede versioner af mikrobielle rhodopsiner, fluorescerende molekyler, der forårsager en ændring i spændingen på tværs af plasmamembranen som reaktion på lys. Disse proteiner kan også fungere omvendt, idet de ændrer deres reaktion på lys – og dermed deres fluorescens – som reaktion på en ændring i membranens spænding.
Alt i detaljen
Så langt har GEVI’er vist sig at være vellykkede til at spore individuelle aktionspotentialer i både dyrkede neuroner, der er dyrket i en skål, og i intakte hjerner fra en lang række dyr, fra insekter5 til mus6. Et af de største løfter i teknikken er dens potentiale til at registrere ikke kun de store hændelser, men også de små ændringer i membranspændingen under tærskelværdien, som afspejler de meddelelser, som en neuron modtager fra nabocellerne, siger Cohen. “Med spændingsbilleder kan man se input til neuronerne in vivo, hvilket vi ikke tidligere havde mulighed for at se på”, siger han.
I det seneste år har Cohen og hans kolleger udviklet nye GEVI’er og forbedret mikroskopiteknikkerne til at registrere sådanne sub-threshold-spændingsændringer fra mange neuroner på én gang, herunder i musens hjerne7,8. Holdet var også i stand til at registrere den elektriske aktivitet af de samme neuroner op til en uge senere. Evnen til at vide præcis, hvilke neuroner der registreres, og til at holde styr på dem over tid gør det muligt for forskerne at se på ledningsføringen mellem disse neuroner, siger Ed Boyden, der er neurovidenskabsmand ved Massachusetts Institute of Technology i Cambridge. På den måde “kan man forbinde hjernens struktur med dens funktion”, siger han. “Det er et af de centrale spørgsmål inden for al neurovidenskab.”
En anden fordel ved GEVI’er er, at de i modsætning til elektroder, som hovedsageligt registrerer signaler fra cellekroppen, kan registrere elektriske signaler fra enhver del af en nervecelle, helt ned til dendriternes spidser (se “Rammer skalaen”). Det svarer til at kunne lytte specifikt til de toner, der spilles af en pianists venstre hånd. “Det er noget, som jeg har drømt om i lang tid – og jeg er ikke den eneste,” siger Katalin Toth, der er neurobiolog ved Laval University i Quebec City i Canada. Mange neurovidenskabsfolk stræber efter at følge spændingen på tværs af hele neuroner for at se, hvordan den ændrer sig i forskellige områder af cellen, siger hun.
Wei Wei, der er neurobiolog ved University of Chicago, Illinois, bruger GEVI’er til at finde ud af, hvordan forskellige elektriske input integreres i neuronerne i musens nethinde. Wei er interesseret i en klasse af neuroner, der reagerer stærkere på en visuel stimulus, når den bevæger sig i en bestemt retning. Ved at se på, hvordan membranspændingen ændrer sig i forskellige dele af disse neuroner, håber hun at forstå, hvordan cellerne summerer de indkommende signaler for at registrere bevægelsesretningen.
Neurophysiolog Vincent Villette ved Ecole Normale Supérieure i Paris planlægger at bruge spændingssensorer til at undersøge, hvordan regelmæssige udsving af sub-threshold elektriske signaler bestemmer, hvordan neuroner i musens lillehjerne koordinerer muskelaktivitet. “Der er meget at forstå i forhold til, hvordan cellerne fungerer sammen,” siger Villette.
Den visuelle aflæsning af membranens spænding gør det også muligt for forskerne at se elektriske signaler, der hæmmer neuronernes affyring i stedet for at udløse den. Fordi hæmmende signaler er umulige at registrere med metoder som f.eks. kalciumafbildning, er det uklart, hvordan de præcist former hjerneaktiviteten, siger Rosa Cossart, en neurobiolog ved Mediterranean Institute of Neurobiology i Marseille, Frankrig.
Cossart har brugt elektroder og kalciumafbildning i årevis, men hun er nu ivrig efter at prøve GEVI’er. Hun håber, at disse sensorer vil gøre det muligt for hende at måle spænding ved høj hastighed på tværs af flere neuroner – mindst 50 – på samme tid i en levende mus. Det vil hjælpe med at forstå, hvordan grupper af neuroner integrerer elektriske signaler – både excitatoriske og inhiberende – for at støtte aktiviteter, der er afgørende for hjernens udvikling og funktion, siger hun.
Dybe udfordringer
Trods de høje forventninger kan det være besværligt at få GEVI’er til at fungere i laboratoriet. Tag Helen Yang: Som kandidatstuderende ved Stanford University i Californien besluttede hun at prøve GEVI’er som en måde at studere neuroner i frugtfluens visuelle system på. Men da Yang kiggede gennem mikroskopet under sit første eksperiment, så hun ingen ændringer i cellernes fluorescens, heller ikke når hun sendte et skarpt lys i fluernes øjne. Det var først, da hun analyserede dataene, at hun indså, at de visuelle stimuli producerede et signal, men det var bare et lillebitte signal. “Jeg var ret begejstret, men det var mine laboratoriekolleger ikke helt så begejstrede,” siger hun. “Reaktionerne var ret små og støjende.”
Yang begyndte at lege med mikroskopets indstillinger og øgede lasereffekten og fremskyndede billeddannelsen. “Jeg fik det stort set til at gå så hurtigt, som vores mikroskop kunne,” siger hun. Det skyldes, at indikatorens reaktion på et elektrisk signal var så hurtig, at ændringen i fluorescens kun kunne registreres i en brøkdel af et sekund. “Hvis man kun optager ét billede i den tid, hvor cellen reagerer, ser responsen slet ikke stor ud,” siger Yang.
Yang formåede til sidst at bruge GEVI’er til at undersøge, hvordan fluernes neuroner behandler visuelle signaler5, men den slags udfordringer, hun stod over for, har indtil videre forhindret, at spændingsafbildning er blevet en mainstream-teknik. Det kræver avancerede, ofte specialbyggede mikroskopiske platforme, siger Cohen. “Du kan ikke bare gøre det på din bedstemors fluorescerende mikroskop.”
I de seneste fem år har finansiel støtte fra BRAIN-initiativet sat skub i fremskridtene på området, herunder udviklingen af bedre GEVI’er, siger Michael Lin, der er proteiningeniør på Stanford.
Parallel med udviklingen af nye sensorer arbejder forskerne på teknikker til med præcision at afbilde de hurtige elektriske signaler, der bevæger sig gennem hjernen. En udfordring er, at de fleste af de tilgængelige teknikker kun fungerer godt med celler i en skål eller på overfladen af hjernen. Men pattedyrs hjerne er ikke gennemsigtig: Faktisk ligner den tofu, siger Na Ji, fysiker ved University of California, Berkeley.
For at se dybere må forskerne ty til mere invasive metoder, f.eks. ved at fjerne noget af det overliggende væv eller ved at stikke små optiske apparater kaldet mikro-endoskoper direkte ind i hjernen. En alternativ, ikke-invasiv metode til at se ind i uigennemsigtigt væv – op til 1 millimeter dybt – er to-fotonmikroskopi. Denne teknik anvender lys med længere bølgelængde og lavere energi, som kan trænge dybere ind i vævet. Da to-fotonmikroskoper kun belyser og optager fra et enkelt punkt ad gangen, optager de billeder for langsomt til at kunne følge meget af hjernens hurtige snak. Men specialisterne er overbevist om, at fremskridt inden for teknologien snart vil gøre det muligt at se de signaler, der produceres af GEVI’er, med højere hastighed. “Det kan absolut lade sig gøre”, siger Ji.
Hvis de forskellige metoder kan overvinde disse udfordringer, er forskerne ikke i tvivl om, at spændingsbilleder vil blive en standardmetode til måling af hjerneaktivitet. “I løbet af det næste år eller to vil vi se en masse artikler, der har anvendt spændingssensorer og lært noget om biologi,” siger Thomas Clandinin, der er neurobiolog på Stanford. Nogle siger, at teknikken måske endda kan erstatte elektroder i forbindelse med spørgsmål om, hvordan neuroner behandler og integrerer information.
Forskere i den tidlige karriere er særligt optimistiske: Hochbaum, som nu er postdoc ved Harvard Medical School i Boston, siger, at GEVI’er på lang sigt vil være et vigtigt redskab til at studere, hvordan forskellige dele af cellen reagerer på sub-threshold-signaler. Han har planer om at bruge spændingsbilleder til at forstå, hvordan sådanne signaler ændrer forbindelsen mellem neuroner, en nøgleproces i indlæring. Mulighederne er spændende, siger Hochbaum, men han har lært mindst én vigtig lektie fra de tidlige dage, hvor han hoppede rundt i laboratoriet i glæde efter at have set en glød i et mikroskop: Når eksperimenterne virker, skal man holde festlighederne på et minimum.