For at demonstrere brugen af Escher-FBA til reelle applikationer præsenterer vi fire vigtige FBA-eksempler, der kan udføres direkte i browseren. Disse er tilpasset fra en gennemgang af FBA og dens anvendelser . Disse eksempler er baseret på standardkernemodellen af E. coli, så de er klar til at blive gennemført, så snart Escher-FBA-websiden åbnes. Sørg for at klikke på knappen Reset Map (nulstil kort) mellem hvert eksempel. Hvis du har problemer med at finde en reaktion, skal du blot klikke på Find-indstillingen i menuen Visning (eller på “f”-tasten på dit tastatur) for at åbne en søgelinje.
FBA med alternative kulstofsubstrater
Det første eksempel demonstrerer brugen af FBA til at forudsige, om der kan ske vækst på alternative kulstofsubstrater. Standardkernemodellen for E. coli omfatter et simuleret minimalt medium med D-glucose som kulstofkilde. Her vil vi skifte kulstofkilden fra D-glucose til succinat. Først placeres musen over succinatudvekslingsreaktionen EX_succ_e, og den nedre grænse ændres til – 10 mmol/gDW/hr., enten ved at trække skyderen eller ved at indtaste – 10 i feltet Lower Bound. Derefter placeres musen over D-glukoseudvekslingsreaktionen EX_glc_e, og enten hæves den nedre grænse til 0, eller der klikkes på knappen Knockout. Standardmålet er stadig at maksimere væksten, så disse to ændringer vil instruere programmet til at beregne den maksimale vækstrate, mens der anvendes succinat som kulstofkilde i stedet for D-glukose. Du bør se, at den maksimale forudsagte vækstrate falder fra 0,874 h- 1 til 0,398 h- 1, hvilket afspejler det lavere vækstudbytte for E. coli på succinat (fig. 2a). Dette er den generelle fremgangsmåde til at foretage ændringer i Escher-FBA; gå med musen over reaktionen, lav de ønskede ændringer, og Escher-FBA vil automatisk vise dine resultater. De nedre grænseværdier for kulstofkildeudveksling repræsenterer eksperimentelle målinger, så du kan prøve at justere den specifikke nedre grænseværdi til realistiske værdier for vækst på andre kulstofkilder.
Eksempler på Escher-FBA-simuleringer. (a) Simuleret vækst med succinat som eneste kulstofkilde. (b) Simuleret anaerob vækst på et glukoseminimalt medium. (c) Maximering af ATP-udbyttet i standardmodellen. (d) Vækst af iMM904-modellen af S. cerevisiae. Bemærk, at pilebredden blev øget i indstillingsmenuen for at gøre ændringerne mere tydelige
FBA under anaerob vækst
Anaerob vækst kan simuleres på samme måde ved at føre musen hen over EX_o2_e-reaktionen og enten klikke på Knockout eller ændre den nedre grænse til 0. Hvis du ændrer iltudvekslingen til nul, mens succinat stadig er den eneste kulstofkilde, viser indikatoren Flux Through Objective “Infeasible solution/Dead cell”, hvilket betyder, at vækst ikke er mulig. Prøv at klikke på knappen Nulstil i nederste højre hjørne for at simulere et minimalt medium med D-glukose som kulstofkilde, og slå derefter EX_o2_e ud, og den forudsagte vækstrate bør være 0,211 h- 1 (fig. 2b).
FBA med sammensatte mål
Escher-FBA understøtter indstilling af flere mål i tilstanden Sammensatte mål. I standardmodellen deaktiverer indstillingen af et nyt mål altid det foregående mål. For at aktivere tilstanden skal du først klikke på knappen Compound Objectives (sammensatte mål) nederst på skærmen. Som et eksempel på brug af tilstanden: For at kontrollere den maksimale vækstrate og samtidig minimere flux gennem SUCDi skal du starte med standardmålet om at maksimere biomasseproduktionen. Hold derefter musen over reaktionsetiketten for SUCDi, og klik på knappen Minimize (Minimer) i værktøjstip’en. Nederst til højre bør du se begge målsætninger opført. Bemærk, at kun målkoefficienter på 1 eller – 1 (repræsenteret ved Maximize og Minimize) understøttes i øjeblikket. Hvis du vil gå tilbage til enkeltmål, skal du blot klikke på knappen Compound Objectives igen.
Analyse af metaboliske udbytter
Vi kan også bruge Escher-FBA til at bestemme det maksimale udbytte af prækursorer og cofaktorer som f.eks. ATP. Det eneste, der kræves, er en stoikiometrisk afbalanceret reaktion, der forbruger den pågældende cofaktor. ATP-vedligeholdelsesreaktionen (ATPM) er et sådant eksempel. For at bestemme den maksimale produktion af ATP skal du blot føre musen hen over ATPM-reaktionen og klikke på knappen Maximer. Denne måde at opstille målet på fungerer, fordi systemet for at maksimere fluxen gennem ATPM-reaktionen først skal producere ATP i den størst mulige mængde for at kunne maksimere den. Når ATPM maksimeres i standardmodellen for E. coli’s kernestofskifte, er målværdien 175 mmol/gDW/hr. (fig. 2c). Med succinat som kulstofkilde falder denne værdi til 82,5 mmol/gDW/hr. Den samme procedure kan følges for enhver metabolit af interesse ved at skabe en stoikiometrisk afbalanceret forbrugsreaktion og indstille modellen til at maksimere fluxen gennem denne reaktion. Bemærk, at det i øjeblikket ikke er muligt at oprette en sådan reaktion automatisk i Escher-FBA, men dette kan tilføjes til en fremtidig version.
Fluxvariabilitetsanalyse
Analyse af alternative optimale løsninger i metabolisme er en anden nyttig anvendelse af FBA . Da de løsninger, der produceres ved hjælp af FBA, ofte er ikke-unikke, kan det være nyttigt at kende det interval af fluxværdier, som en bestemt reaktion kan have. Fluxvariabilitetsanalyse (FVA) bruges ofte til at beregne disse intervaller på tværs af hele netværket . Escher-FBA understøtter ikke direkte FVA-beregninger, men det er muligt at beregne dem for en given reaktion. For at gøre dette skal du først gå med musen over målfunktionen (biomassereaktionen Biomass_Ecoli_core_w_GAM) og indstille de øvre og nedre grænser til lidt mindre end den aktuelle fluxværdi (i standardkortet skal du prøve 0,870). Hold derefter musen over en reaktion af interesse, og klik på knapperne Maximize og Minimize for at se den maksimale og minimale flux gennem den pågældende reaktion givet den optimale væksthastighed. For eksempel giver maksimering og minimering af flux gennem GAPD i glykolyse et muligt fluxområde på 15,44-16,68 mmol/gDW/hr., hvilket indikerer, at glykolytisk flux er stærkt begrænset ved høje vækstrater. På den anden side giver maksimering og minimering af flux gennem MALS i glyoxylatshunten et muligt fluxområde på 0-2,64 mmol/gDW/time, hvilket indikerer, at glyoxylatshunten kan være aktiv eller inaktiv ved høje vækstrater. Denne procedure kan udføres med et hvilket som helst sæt reaktioner, og brugeren kan begrænse sit system til et vilkårligt antal fluxværdier for at se intervallet af løsninger, der er tilgængelige for en bestemt reaktion.
Anvendelse af andre modeller i genomskala
Den standard E. coli-kernemodel er ikke det eneste system, der kan simuleres. Hvis man f.eks. ønsker at køre simuleringer på en gærcelle, kan man downloade en model og et kort for Saccharomyces cerevisiae fra http://bigg.ucsd.edu/models/iMM904. På denne side skal man klikke på download-knappen for modellen (iMM904.json) og kortet (iMM904.Central carbon metabolism.json). Indlæs disse i Escher-FBA ved at klikke på Load Map JSON i menuen Map og Load Model JSON i menuen Model for at indlæse begge JSON-filer. Når kortet er indlæst, er det klar til at blive redigeret og simuleret med et af værktøjerne i Escher eller Escher-FBA (fig. 2d). Med en større model som iMM904 vil ikke alle reaktioner være synlige på en gang, men du kan tilføje en reaktion til visualiseringen. Først klikker du enten på skruenøgleikonet på sidebjælken eller vælger Add reaction mode (Tilføj reaktionstilstand) i Edit-menuen. Nu kan reaktioner tilføjes ved at klikke et vilkårligt sted på kortet og vælge den ønskede reaktion fra drop-down-menuen. Tekstindtastningsfeltet kan bruges til at søge efter en reaktion af interesse.
Anvendelse af Escher-FBA på design af mikrobielle cellefabrikker
For at give et eksempel på en forskningshypotese, der kan testes ved hjælp af Escher-FBA, indlæste vi modeller i genomskala af E. coli, der indeholder to ruter til produktion af 1-propanol til kemisk produktion. Disse veje blev for nylig analyseret i en undersøgelse af den prædiktive kraft af modeller i genomskala til simulering af virkelige mikrobielle cellefabriksstammer . Den første model omfatter en enkelt vej til produktion af 1-propanol (Additional file 1), som først blev rapporteret af Atsumi et al. . Den anden model omfatter to synergistiske veje til produktion af 1-propanol (Additional file 2), der først blev rapporteret af Shen og Liao . Hver model kan indlæses separat (med menuknappen Model > Load COBRA model JSON), og der leveres et enkelt kort over det centrale stofskifte, som er kompatibelt med begge modeller (Yderligere fil 3, kan indlæses med Map > Load Map JSON).
Vi var nysgerrige efter at vide, om den synergistiske tilgang til 1-propanolproduktion – som er kendt for at have et højere produktionsudbytte – også har en forskel i den nødvendige brug af veje. Derfor indlæste vi hver model individuelt, maksimerede udskillelsen af 1-propanol (svævede over EX_1poh_e og klikkede på Maximer), satte den nedre grænse for udskillelsen til 99 % af maksimum og minimerede derefter flowet gennem det første engagerede trin i pentosephosphatvejen, glukose-6-fosfatdehydrogenase (G6PDH2r). De resulterende kort viser, at de synergistiske veje til produktion af 1-propanol er stoikiometrisk afbalanceret med glykolyse, så de kræver ikke PPP-aktivitet (Fig. 3b). På den anden side kræver den individuelle vej en betydelig PPP-flux (fig. 3a). Anden vejanvendelse, såsom den nødvendige TCA-flux for hvert enkelt tilfælde, kan også udforskes på disse kort.
Vejanvendelse for to heterologe veje til 1-propanolproduktion i E. coli. Den pentosephosphatvejs (PPP) flux, der er nødvendig for hver heterolog produktionsvej, kan sammenlignes ved for det første at tvinge produktionen af 1-propanol til at være 99 % af den maksimale værdi (ved at sætte den nedre grænse for 1-propanoludvekslingsreaktionen) og for det andet at minimere fluxen gennem det første trin i PPP’en. (a) Den 1-propanolvej, der er rapporteret af Atsumi et al., anvender en enkelt vej til at opnå 1-propanolproduktion. Den kræver en betydelig PPP-flux og har et lavere samlet udbytte. (b) Den vej, der er rapporteret af Shen og Liao, anvender to veje synergistisk for at opnå et højere udbytte. Vejen er stoikiometrisk afbalanceret med glykolyse, så den kræver ingen PPP-flux
Mens Escher-FBA allerede kan anvendes til mange FBA-simuleringer direkte i webbrowseren, kan en række af de eksempler, som Orth et al. præsenterer, ikke i øjeblikket gennemføres med Escher-FBA . Lige nu kan Escher-FBA ikke udføre funktioner som f.eks. gen knockout-analyse eller robusthedsanalyse. Escher-FBA anvender imidlertid fleksible SVG-repræsentationer for visuelle elementer, så robusthedsanalyse og endda grafiske funktioner som f.eks. faseplaner kan tilføjes. Vi har udarbejdet en udviklingskøreplan for Escher-FBA (tilgængelig fra hjemmesiden https://sbrg.github.io/escher-fba) og en iterativ udviklingsproces for i sidste ende at muliggøre komplekse systembiologiske analyser i webbrowseren.