Tabel 1
Excitation, emission og lysstyrke
Hvis du planlægger at bruge flere fluorescerende tags, er det vigtigt at vælge et med tydelige emissionstoppe – samt excitationstoppe, som du kan ramme med de lasere, du har til rådighed. Hvis emissionstoppene overlapper hinanden, vil det være vanskeligt eller muligvis umuligt at skelne dem fra hinanden.
Du ønsker typisk det lyseste fluorescerende tag inden for dine tilgængelige spektrer for at opnå et klart signal og overvinde en eventuel baggrundsfluorescens. Lysstyrkeværdier er et produkt af proteinets extinktionskoefficient og kvanteudbytte. Det resulterende tal kan imidlertid være vanskeligt at fortolke, og derfor er et fluorescerende tags lysstyrke i forhold til et veldefineret tag, som EGFP, et almindeligt alternativt mål.
Maturering og blegning
Maturering definerer, hvor lang tid det tager et fluorescerende tag at folde sig korrekt, danne chromoforen og begynde at fluorescere. For tidsfølsomme begivenheder i levende celler kan en kort modningstid være vigtig. Superfolder GFP (sfGFP) kan f.eks. foldes på under 10 minutter, mens mOrange kan tage over fire timer.
Blegning er et mål for fotostabilitet, dvs. hvor længe efter excitation kromoforen mister evnen til at udsende lys. Hvis du planlægger at udføre langvarige time-lapse-eksperimenter, skal du overveje et tag med en høj fotostabilitet. T-safir har en blegningshalveringstid (t½; tid for en indledende emissionsrate på x fotoner/s til at blive halveret) på 25 sekunder, men EGFP er meget mere stabil med en blegningshalveringstid t½ på 174 sekunder.
Miljøforhold
Lige de fleste proteiner påvirkes fluorescerende tags af pH, temperatur og iltindhold. Afhængigt af det miljø, du planlægger at bruge, skal du måske enten justere betingelserne en smule eller vælge et mere passende tag.
Ph-værdien kan påvirke excitations- og emissionstoppene, og de fleste fluorescerende tags er følsomme over for syre: nogle kan endda ændre fluorescerende intensitet ved pH-ændringer (f.eks. pHTomato). pKa-værdien er en god indikator for pH-følsomhed, da den viser den pH-værdi, ved hvilken halvdelen af kromohorerne er fluorescerende.
Dertil kommer, at temperatur og iltniveau begge påvirker modningstiden: hypoxiske forhold har tendens til at forsinke modningstiden, ligesom temperaturer uden for det optimale område for den fluorescerende tags (f.eks. EGFP er blevet optimeret til at fungere ved 37 °C). Nyere fluorescerende tags som UnaG, en GFP, der er isoleret fra den japanske ferskvandsål (Anguilla japonica), fluorescerer imidlertid, selv når iltniveauet er lavt3.
Kodonoptimering
Da de fleste fluorescerende tags stammer fra manet- eller koralproteiner og ikke fra noget, der ligner de pattedyrceller og -væv, som man sandsynligvis vil bruge dem i, kan der være en forskel mellem arterne i de anvendte aminosyrekodoner. Dette kan føre til dårlig ekspression og dermed et lavt signal.
Glædeligvis er mange af de nyere versioner af fluorescerende tags blevet kodon-optimeret til at afspejle præferencerne for pattedyrsceller. I GFP f.eks. forbedrede Jürgen Haas og kolleger signalet 40-120 gange ved at ændre GFP-kodonsekvensen4.
Hvis du bruger et ældre plasmid til at generere dine fusionsproteiner, indeholder det måske ikke en modificeret fluorescerende tag-sekvens. Kontroller derfor altid, om din sekvens er blevet modificeret til brug i en bestemt art.
Oligomerisering
Det er vigtigt at afgøre, om dit tag er en monomer eller dimer (monomerer angives normalt med et “m” foran proteinnavnet, f.eks. mCherry), og om dette påvirker dit eksperiment eller ej. Mange af de tidlige fluorescerende tags var tilbøjelige til at danne oligomerer, og oligomerisering kan påvirke fusionsproteinets biologiske funktion. EGFP er f.eks. en monomer, der kan danne dimerer, når den anvendes i tilstrækkeligt høje koncentrationer, hvilket kan forvrænge subcellulære organeller5 eller forstyrre eksperimenter som FRET6. Virkelig monomere FP’er anbefales i langt de fleste tilfælde.
GFP- og mCherry-produkter