Forbedring af opløseligheden af rekombinante proteiner ved hjælp af MBP-tag

Ressourcer “Tekniske ressourcecentre “Tekniske ressourcer om proteiner” “Tekniske ressourcer om proteiner” “Teknisk Noter “MBP-tag

E. coli-ekspression

Generering af rekombinant protein kræver brug af en ekspressionsvært, og E. coli er normalt det bedste valg til dette formål. Kombinationen af enkel genetik, nem dyrkning, hurtig ekspression og høje udbytter gør det til en attraktiv vært, mens manglen på et effektivt posttranslationsmaskineri, kodonbrugsbias og vanskeligheder med at producere proteiner med højere molekylvægt gør det til en ulempe. Et af de største problemer ved E.coli-ekspression er imidlertid uopløselig ekspression – det fænomen, hvor rekombinant overekspression resulterer i dannelse af uopløselige proteinaggregater kaldet inklusionskroppe.

Måder at håndtere inklusionskroppe og forbedre målproteinets opløselighed

Når der dannes inklusionskroppe, forsøger forskerne normalt en besværlig proces kaldet in vitro-proteinopløsning og genfoldning for at genvinde opløseligt protein, eller de forsøger ekspressionsoptimering på proces- eller molekylært niveau for at forhindre problemer med uopløselighed .

Eksempler på optimering på procesniveau omfatter metoder, der ikke kræver målteknologi. F.eks. optimering af ekspressionsbetingelserne, justering af vækst- og induktionsbetingelserne, ændring af medier, buffere osv. Et alternativ ville være at afprøve en molekylær tilgang og manipulere målproteinet ved at fjerne uønskede elementer i dets sekvens ved at skabe truncations eller mutere visse aminosyrer for at gøre proteinet mere opløseligt. Man kan også anvende en rationel, stedbestemt mutagenese baseret på oplysninger om strukturen eller benytte sig af en tilgang baseret på en rettet evolution og screene for opløseligheden af tilfældige punktmutanter, deletioner og fragmenter. En bedre og nemmere tilgang ville være at anvende en fusionspartnerstrategi og bruge en fusionspartner opstrøms, som ville gøre målproteinet mere opløseligt.

Fusionspartnerstrategi til forbedring af proteinets opløselighed

Med denne tilgang fusioneres et protein eller peptid, der er vanskeligt at udtrykke, med et andet stabilt, meget opløseligt protein for at stabilisere ekspressionen, med den idé, at fusionsproteinet vil drive den resulterende ekspression. Selv om mange proteiner er meget opløselige, er de ikke alle effektive som proteinopløselighedsforstærkere. I denne henseende kan maltosebindende protein være en meget nyttig partner for proteinopløselighed . I en sammenlignende undersøgelse med henblik på at undersøge deres proteinopløselighedsfremmende egenskaber viste E. coli MBP-tag sig at være en langt mere effektiv proteinopløselighedspartner end Glutathion-S-transferase (GST) og Thioredoxin (TRx)-proteinerne.

Figur 1: GenScript scientist anbefaling vedrørende konstruktionsdesign

Om MBP-tag og dets virkningsmekanisme

MBP er et ca. 42 kDa, naturligt forekommende protein i E. coli, kodet af malE-genet, som er ansvarlig for optagelsen, nedbrydningen og transporten af maltodextrin, et kulhydrat. Det blev oprindeligt udviklet som et proteinekspressionstag i 1980’erne og er kendt for at øge opløseligheden af en række nedstrømsfusionerede målproteiner betydeligt. Selv om den nøjagtige mekanisme til forbedring af proteinopløseligheden ved hjælp af MBP-mærket er uklar, er det kendt, at det stabiliserer og beskytter sit downstream-passagerprotein mod proteolytisk nedbrydning under og efter proteinsyntesen. Det cytoplasmatiske udbytte af MBP-fusionerede proteiner er normalt også højere, fordi fusionsproteinet giver pålidelige kontekster for effektiv translationsinitiering. Det foreslås også, at MBP-tagget kan fungere som chaperon ved interaktioner gennem et opløsningsmiddeleksponeret hotspot på dets overflade, som stabiliserer det ellers uopløselige passagerprotein.

Anvendelse af MBP-tag

Mens MBP-tagget er fusioneret til enten N- eller C-terminus har vist sig at øge rekombinant opløselig ekspression, er en almindelig fremgangsmåde at fusionere det til N-terminus. Da intet tag desværre kan være ideelt til alle anvendelser, er der for at øge alsidigheden af tags og downstream-applikationer desværre blevet udviklet kombinatoriske taggingmetoder til forskellige behov. To affinitetsmærker udtrykt i tandem sammen med et protease-spaltningssted forud for målproteinet gør det muligt at anvende flere oprensningsstrategier. Ved at inkorporere et opløselighedsforbedrende tag i kombination med et oprensningstag opnås forbedringer i proteinopløseligheden og ekspressionsudbyttet samt metoder til effektiv oprensning

Figur 2: Et generelt skema for konstruktionsdesignstrategi – affinitets/opløseligheds-tag kombination ved N-terminus, proteolytisk spaltningssted efterfulgt af målproteinet kan give gode resultater, især for uopløselige målproteiner. En linkersekvens kan ofte hjælpe med problemer med proteolytisk spaltning.

Rensning af MBP-mærkede proteiner

En anden fordel ved at anvende en MBP-fusionsstrategi ud over forbedring af proteinets opløselighed er, at den letter rensningen af downstream-målproteinet. MBP er et naturligt affinitetsmærke, der binder til amyloseharpiks, og det kan udnyttes til affinitetsrensning i et enkelt trin ved at binde til tværbunden amylose. MBP-tag-fusionerede rekombinante proteiner, der er bundet til immobiliseret amylose, elueres typisk under ikke-denaturerende forhold ved hjælp af maltose .

Ulemper ved denne strategi

• Målproteinspaltning kan være et problem på grund af sterisk hindring fra MBP-tag
• Amyloseharpiksen kan være skrøbelig og relativt dyr
• Målproteinudfældning efter spaltning
• Nogle MBP-fusionsproteiner binder ikke effektivt til amyloseharpiksen, og selv når de gør det, er de ikke bundet effektivt, kan udbyttet være et problem

Slutning

Selv om der ikke findes en enkel, global løsning til at løse problemerne med uopløselighed i E.coli-ekspression, kan et veludviklet konstrukt og en omhyggeligt udformet ekspressionsstrategi give dig det ønskede opløselige protein. MBP er et pålideligt opløselighedstag til rekombinant produktion af opløseligt protein, og selv om opløselighed er et af de vigtigste elementer i en proteinproduktionskampagne, bør slutmålet ikke altid handle om opløselighed. Ekspressionsniveauer, proteinaktivitet, renhed, homogenitet og stabilitet er alle vigtige faktorer, som også skal tages i betragtning, før man går i gang med en rekombinant proteinproduktionskampagne.

Få publikationer, der viser nytteværdien af MBP-tag

Produktion af Fusokiner ved hjælp af MBP -Maltose-Binding Protein Fusion muliggør bakteriel ekspression på højt niveau og oprensning af bioaktive pattedyrs cytokinderivater (september 2014)

Redning af aggregations-prone proteins using MBP -Rescuing aggregation-prone proteins in Escherichia coli with a dual His₆-MBP tag (May 2014)

MBP for soluble protein production in E. coli -Hexahistidin-mærkede maltosebindende protein som en fusionspartner til produktion af opløselige rekombinante proteiner i Escherichia coli (2009)

1. Pryor, K. A., og Leiting, B. (1997). Ekspression på højt niveau af opløseligt protein i Escherichia coli ved hjælp af et His6-tag og maltosebindende protein dobbelt affinitetsfusionssystem. Protein Expr. Purif. 10, 309-319
2. Routzahn, K. M. og Waugh, D. S. (2002). Differentielle virkninger af supplerende affinitetsmærker på opløseligheden af MBP-fusionsproteiner. J. Struct. Funct. Genomics 2, 83-92
3. Nallamsetty, S., Austin, B. P., Penrose, K., J., og Waugh, D. S. (2005) Gateway-vektorer til produktion af kombinatorisk taggede His6-MBP-fusionsproteiner i cytoplasmaet og periplasmaet af Escherichia coli. Protein Sci. 14, 2964-2971
4. Esposito D, Chatterjee DK: Forbedring af ekspression af opløselige proteiner gennem brug af fusionsmærker. Curr Opin Biotechnol 2006, 17:353-8.184.
5. Peti W, Page R: Strategier til maksimering af heterolog proteinekspression i Escherichia coli med minimale omkostninger. Protein Expr Purif 2007, 51:1-10.]
6. Wilkes D.M.: Ekspression og oprensning af det første nukleotidbindende domæne og linker-regionen af det humane multidrugresistensgenprodukt: sammenligning af fusioner med glutathion S-transferase, thioredoxin og maltosebindende protein. Biochemical Journal 1999, 77-81
8. Fox JD, Kapust RB, Waugh DS: Enkelte aminosyresubstitutioner på overfladen af Escherichia coli maltosebindende protein kan have en dybtgående indvirkning på opløseligheden af fusionsproteiner. Protein Sci 2001, 10:622-630

Planlægger du et projekt om bakterieekspression? Få et gratis tilbud inden for få sekunder på vores BacPower™ garanterede proteinekspressionspakker.

Opgaver og bestilling

#Automatisk tilbud vil kun blive genereret, hvis sekvenser kvalificerer sig til den garanterede service, som bestemt af vores proprietære sekvensanalyseplatform, i mangel af hvilken vores tekniske kundechef vil kontakte dig med et tilbud på en skræddersyet proteinproduktion. Du kan være sikker på, at vores tilpassede tjenester er af lige så høj kvalitet og konkurrencedygtige som vores garanterede tjenester.

Vores kundeservicemedarbejdere er tilgængelige 24 timer i døgnet, mandag til fredag, for at hjælpe dig.