Frontiers in Medicine

Introduktion

Kolonoskopi er den foretrukne metode til at vurdere tarmsundheden hos de fleste patienter, og det er den gyldne standard for diagnosticering af kolorektal cancer, som klart kan opdage tarmlæsioner (1). Før koloskopi anvendes tarmforberedelse almindeligvis for at sikre, at der ikke er rester tilbage i tarmvæggen, som kan påvirke undersøgelsesprocessen og resultaterne via anvendelse af justeret kost og relaterede lægemidler, og tarmforberedelsens tilstrækkelighed kan direkte påvirke den endelige effekt af koloskopien (2). På nuværende tidspunkt anvendes polyethylenglycol (PEG) i vid udstrækning til tarmrensning før koloskopi på grund af dets effektivitet og omfattende acceptabilitet (3).

Som vi ved, er tarmmikrobiotaen vigtig for at opretholde menneskers sundhed. Under fysiologiske forhold sameksisterer symbiotiske fysiologiske anaerobe bakterier, symbiotiske betingede patogene bakterier og andre skadelige bakterier i tarmkanalen i et stabilt forhold. Men når tarmens mikrobiota ændres, eller når andelen af tarmens mikrobiota er ude af balance, vil der ske tilsvarende patofysiologiske ændringer (4). Under tarmforberedelsesproceduren trænger der en stor mængde væske ind i tarmkanalen og forstyrrer i høj grad miljøet i den normale tarmhule, og indtagelse af afføringsmidler kan øge tarmdyskinesien og tarmperistaltikken, hvilket gør, at bakterier ikke kan klæbe til tarmslimhinden (5). Desuden reducerer den store mængde ilt, som tarmpræparatet bringer med sig i tarmmiljøet, kraftigt antallet af anaerobe bakterier og fremmer væksten af aerobe bakterier, hvilket resulterer i tarmens mikrobielle forstyrrelse (6).

Probiotika er “levende mikroorganismer, der kan have gavnlige virkninger på værten ved indtagelse af tilstrækkelige doser” (7), tidligere undersøgelser tyder på, at probiotika spiller en aktiv rolle i en række menneskelige sygdomme, herunder irritabel tarmsyndrom, inflammatorisk tarmsygdom og tarmkræft (8, 9). Vores tidligere undersøgelser viste, at probiotiske præparater har vigtige virkninger med hensyn til at reducere inflammatorisk respons efter gastrostomi og forbedre gastrointestinale symptomer hos postoperative patienter (10), og probiotiske præparater lindrede også betydeligt oral slimhindebetændelse forårsaget af strålebehandling hos patienter med nasopharyngealt karcinom (11). Selv om man har været opmærksom på bivirkningerne ved tarmpræparater, f.eks, ubalance af tarmmikrobiotaen og skader på tarmslimhinden i akademiske kredse, er der kun udført lidt arbejde for at reducere bivirkninger af tarmpræparat ved hjælp af probiotisk supplement.

I denne undersøgelse blev det kliniske probiotiske lægemiddel af Bifidobacterium Tetragenous viable Bacteria Tablets anvendt til at evaluere dets effekt på frivillige, der modtog tarmpræparat, og der blev anvendt højhastigheds-sekventering for at vurdere, om probiotika havde positive virkninger på tarmmikrobiotaforstyrrelser forårsaget af tarmpræparat.

Materialer og metoder

Ethisk erklæring

Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Boards of the Second Affiliated Hospital of Nanchang University (Nanchang, Kina). Patienterne gav skriftligt informeret samtykke til prøveudtagning. Projektet er også blevet registreret og godkendt af China Clinical Trial Registration Centre (ChiCTR1900022539).

Studieudformning og patientregistrering

Studiet blev gennemført på Second Affiliated Hospital of Nanchang University i Kina mellem december 2018 og november 2019. 32 forsøgspersoner (29 mænd, 3 kvinder) med en gennemsnitsalder på 51 år (interval 30-70 år), en højde på 1,66 m, en vægt på 61,78 kg og et kropsmasseindeks (BMI) på 22,39 blev tilmeldt. Fem deltagere havde en historie med hypertension, fire havde en historie med diabetes, og tre havde en historie med hypertension og diabetes. I henhold til reglerne blev medicinen ikke afbrudt under undersøgelsesforløbet. Desuden tog ingen deltager antibiotika under emnet og havde heller ikke udviklet infektion for nylig, og der blev ikke taget andre probiotika og yoghurter. Ingen af disse frivillige var vegetar (tabel 1).

Protokol til forsøget

De 32 frivillige blev inddelt i to grupper: placebogruppe (C-gruppen, n = 16) og probiotikagruppe (P-gruppen, n = 16). Probiotiske (Bifidobacterium Tetragenous viable Bacteria Tablets (SiLianKang), Hangzhou Grand Biologic Pharmaceutical Inc., Hangzhou, Kina. SFDA-godkendelsesnummer: S20060010, indeholdende >0,5 × 106 CFU/table Bifidobacterium infantis, >0,5 × 106 CFU/table Lactobacillus acidophilus, >0,5 × 106 CFU/table Enterococcus faecalis, og >0,5 × 105 CFU/table Bacillus cereus). Deltagerne blev foreslået at spise grød, nudler og andre fiberfattige diæter dagen før tarmforberedelse, og spiste normalt diæter efter koloskopi. Antibiotika var forbudt under behandlingsforløbet, ligesom drikkevarer og acrimoni var forbudt. Alle begyndte at tage placebo eller probiotiske præparater efter koloskopi i op til 5-7 dage (tre tabletter og tre gange om dagen).

Deltagerne tog 2 L polyethylenglycol (PEG, SFDA-godkendelsesnummer: H20020020031, indeholdende pakke A: 0,74 g kaliumklorid og 1,68 g natriumbicarbonat, pakke B: 1,46 g natriumklorid og 5.68 g natriumsulfat, pakke C: 60 g polyethylenglycol 4.000) 4-5 timer før koloskopi, og PEG bør indtages fuldstændigt inden for 1 time. Efter intravenøs anæstesi med 1 ml lidocainhydrochloridinjektion (SFDA-godkendelsesnummer: H37021309), 1 ml nalbufinhydrochloridinjektion (SFDA-godkendelsesnummer: H20130127) og 20 ml propofolemulsioninjektion (SFDA-godkendelsesnummer: H20051843), gennemgik deltagerne koloskopi. Hvis deltagerne var intolerante under koloskopien, blev der tilsat bedøvelsesmidler efter behov. Der blev opsamlet afføring i 3 tidspoint (3 dage før, samme dag som tarmforberedelsen lige før koloskopien og 7 dage efter processen). De indsamlede prøver blev opbevaret i 50% glycerol (Cat#56-81-5; Sengon Biotech, Kina) og straks opbevaret ved -80°C til videre brug.

Total bakteriel genomisk DNA-ekstraktion og high-throughput-sekventering

I alt 96 afføringsprøver blev indsamlet, og metoden med bead blasting kombineret med genomisk DNA-kit (Tiangen Biotech Co., Ltd., Beijing, Kina) blev anvendt til at ekstrahere fækalt mikrobielt DNA (12). Koncentrationen og renheden af rensede DNA’er blev bestemt ved hjælp af et spektrofotometer ved 230 nm (A 230) og 260 nm (A 260) (NanoDrop; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). V4-regionen af 16S rDNA-genet i hver prøve blev amplificeret med 515F/806R-primeren (515F, 5′-GCACCTAAYTGGGYDTAAAGNG-3′; 806R, 5′- TACNVGGGGGGTATCTAATCC-3′), og PCR-produkterne blev sekventeret på IlluminaHiSeq 2000-platformen (GenBank-adgangsnummer PRJNA597277) (13).

Dataanalyse

For at analysere højhastigheds-sekventeringsdataene blev Cutadapt (version 1.9.1, http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/), UCHIME-algoritmen http://www.drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.html, UPARSE-softwarepakken (version 7.0.100), QIIME-software (version 1.9.1), QIIME-softwarepakke (version 1.8.0) og SIMCA-P-software (version 11.5; Umetrics; Sartorius Stedim Biotech, Malmø, Sverige) blev anvendt til at bestemme α-diversiteten (inden for prøver, indeks for observerede OTU’er, Chao1, Shannon, Simpson, ACE og varedækning) og β-diversiteten (mellem prøver, PCA, PCoA og NMDS) (14, 15).

Data er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (SD). Statistiske analyser blev udført ved hjælp af Prism-software (version 7.0; GraphPad Software, San Diego, CA, USA) og SPSS 17.0-software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af envejsanalyse af varians (ANOVA) efterfulgt af Tukey’s multiple sammenligningstest og F-test. Fejlsandsynligheder på P < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikante.

Resultater

Patienternes baselinekarakteristika

Mellem december 2018 og november 2019 blev 32 frivillige indskrevet i placebogruppen (C-gruppen, 16 frivillige) og probiotikagruppen (P-gruppen, 16 frivillige), og deres køn, alder, BMI, baselinekarakteristika, tidligere sygehistorie og gastrointestinale reaktion før og efter tarmpræparering blev opsummeret i tabel 1. Der var ingen signifikant forskel mellem C-gruppen og P-gruppen.

Effekt af tarmforberedelse på tarmmikrober

For at undersøge, om tarmforberedelse kan påvirke tarmmikroorganismer, blev V4 hypervariabel region af bakterier amplificeret ved hjælp af 16S rDNA amplicon-sekventeringsmetoden fra afføring fra 16 frivillige før (CB-gruppen), under (CM-gruppen) og efter tarmforberedelse (CA-gruppen).

I figur 1A-C viste Shannon-indekset, Simpson-indekset og observerede arter, at forekomsten af tarmforberedelse påvirkede α-diversiteten af tarmens mikrobielle samfund svagt mellem CB- og CM-grupperne, CB- og CA-grupperne, mens den mikrobielle diversitet mellem CM- og CA-grupperne blev påvirket signifikant (P < 0,05). Og hovedkoordinatanalysen (PCoA) viste, at den mikrobielle diversitet i CM-gruppen og CA-gruppen var forskellig sammenlignet med den i CB-gruppen (figur 1D). Desuden viste resultaterne af Venn-indekset (Figur 1E), at der var 2 068, 3 426 og 1 695 OTU’er i CB-, CM- og CA-grupperne, og deres procentdel af fælles OTU’er var henholdsvis 27,71 % (573/2 068), 16,73 % (573/3 426) og 33,81 % (573/1 695).

Dertil kommer, at vi yderligere analyserede de dominerende bakterier på phylumniveau (figur 2A-E) og fandt, at Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes og Actinobacteria var de fremherskende phylaer i disse 3 grupper. Resultaterne viste, at tarmpræparatet øgede den relative forekomst af Proteobacteria (0,266 vs. 0,410), mens det mindskede den relative forekomst af Actinobacteria (0,044 vs. 0,029) og havde en lille effekt på den relative forekomst af Firmicutes (0,462 vs. 0,408) og Bacteroidetes (0,194 vs. 0,136) i forhold til CB-gruppen. Syv dage efter tarmpræparationen faldt den relative hyppighed af Proteobakterier fra 0,410 til 0,335. Mærkeligt nok steg den relative abundans af Actinobacteria fra 0,029 til 0,119, mens den relative abundans af Firmicutes (0,409 vs. 0,389) og Bacteroidetes (0,136 vs. 0,126) stadig viste en faldende tendens i forhold til CM-gruppen. På slægtsniveau (figur 2F-J) blev det under tarmpræparationen observeret, at den relative abundans af Bacteroides og Acinetobacter var dominerende bakterier, idet den relative abundans af Acinetobacter (0,042 vs. 0,042 vs. 0,176) var signifikant forøget, og den relative hyppighed af Streptococcus (0,020 vs. 0,008), Bifidobacterium (0,036 vs. 0,022) og Faecalibacterium (0,075 vs. 0,065) var let ændret sammenlignet med CB-gruppen. Syv dage efter tarmpræparationen var der imidlertid en signifikant stigning i procentdelen af Streptococcus (0,007 vs. 0,068) og Bifidobacterium (0,022 vs. 0,068) og Bifidobacterium (0,022 vs. 0.109) og et fald i den relative hyppighed af Faecalibacterium (0,065 vs. 0,031) og Acinetobacter (0,176 vs. 0,136) sammenlignet med CM-gruppen.

Effekt af probiotisk præparat på intestinal mikrobiel balance

For at evaluere virkningerne af probiotika på intestinal mikrobiota hos frivillige, der modtog tarmpræparat, blev afføring indsamlet før (PB-gruppe), under (PM-gruppe) og efter tarmpræparat (PA-gruppe) i 7 dage (har taget probiotisk præparat i 5-7 dage).

Vi observerede, at tarmpræparatet havde påvirket α-diversiteten på Shannon-indekset (Figur 3A) og Simpson-indekset (Figur 3B, P < 0,05) af det mikrobielle samfund markant mellem PB- og PM-grupperne. Interessant nok fik de observerede arter en tydelig stigning efter tarmpræparationen, men en tydelig reduktion 7 dage efter behandlingen (Figur 3C). Desuden viste PCoA-resultaterne, at indtagelse af probiotika i høj grad genoprettede den forstyrrede mikrobiota til et normalt niveau i PM-gruppen og PA-gruppen (Figur 3D), og de fælles OTU’er optog 28,68 % (508/1.771), 23,67 % (508/2.146) og 36,92 % (508/1.376) af de samlede OTU’er i henholdsvis PB-, PM- og PA-gruppen.

Derpå evaluerede vi yderligere virkningerne af probiotisk intervention på den mikrobielle sammensætning, og fandt supplementering af probiotika reducerede Proteobakterier signifikant (0.515 vs. 0,173) og øgede kraftigt den relative abundans af Bacteroides (0,166 vs. 0,338) i PM-gruppen sammenlignet med PA-gruppen på phylumniveau (P < 0,05). På slægtsniveau havde de supplerede probiotika tydeligvis reduceret procentdelen af Acinetobacter (0,204 vs. 0,071) i PM-gruppen sammenlignet med PA-gruppen og signifikant øget procentdelen af Bifidobacterium (0.017 vs. 0,110), Bacteroides (0,095 vs. 0,155) og Faecalibacterium (0,028 vs. 0,060) i PM-gruppen sammenlignet med PA-gruppen (figurer 4F-J).

De mikrobielle ændringer mellem grupperne CA-gruppe og PA-gruppe

For bedre at forstå effekten af probiotika på tarmforberedelse sammenlignede vi den mikrobielle diversitet mellem frivillige i grupperne CA og PA. Som vist i figur 5A-C havde supplementering af probiotika markant forbedret Shannon-indekset og Simpson-indekset (P < 0,05), mens de observerede arter blev reduceret. PCoA-resultaterne viste, at prøverne i CA-gruppen og PA-gruppen spredte sig langt væk fra hinanden (figur 5D). Der var 1.695 og 1.376 OTU’er i CA-gruppen og PA-gruppen, og det fælles OTU-nummer var 570 (Figur 5E). Desuden viste Lefse-analysen, at Bacteroidia (ved klasse), Bacteroidetes (ved phylum), Bacteroidaceae (ved familie), Bacteroides (ved slægt), Fusobacteriaceae (ved familie), Porphyromonadaceae (ved familie) og Parabacteroides (ved slægt) var signifikant højere i PA-gruppen end i CA-gruppen (Figur 5F).

Derpå blev specifikke bakterier i CA-gruppen og PA-gruppen sammenlignet. Supplering af probiotika berigede markant procentdelen af Bacteroidetes (0,126 vs. 0,338), mens procentdelen af Proteobacteria (0,335 vs. 0,173) og Firmicutes (0,389 vs. 0,330) blev reduceret i forhold til PA-gruppen på phylumniveau (P < 0,05). På slægtsniveau (figur 6E-K) mindskede tilskuddet af probiotika den relative forekomst af Acinetobacter (0,136 vs. 0,071) og Streptococcus (0,068 vs. 0,023), mens det øgede den relative forekomst af Bacteroides (0,136 vs. 0,071), mens det øgede den relative forekomst af Bacteroides (0.068 vs. 0,155), Roseburia (0,02 vs. 0,04), Faecalibacterium (0,031 vs. 0,060) og Parabacteroides (0,16 vs. 1,92%).

Diskussion

Tarmrensning er nødvendig under koloskopi, og dens langvarige brug af sikkerhed gør, at folk ignorerer dens negative indvirkning på tarmens mikroorganismer (16). Som bekendt er mikroorganismer i tyktarmen grundlaget for at fremme normale fysiologiske funktioner hos pattedyr, herunder angiogenese, metabolisme, fordøjelse og udvikling af immunsystemet (17). Desuden vil forskellige sygdomme, herunder fedme, type 2-diabetes, kolorektal cancer og inflammatorisk tarmsygdom, opstå, når tarmmikrobiotaen er ude af balance (8, 9, 18).

De vigtigste komponenter i det normale tarmmikroøkosystem er obligate anaerobe bakterier (Bacteroidetes og Firmicutes), og fakultative anaerobe bakterier (såsom Proteobakterier) udgør normalt kun en lille del, og ubalancen i tarmmikrobiotaen skyldes ofte et stigende antal fakultative anaerobe bakterier (19). Tarmpræparatet kan bringe en stor mængde ilt ind i tarmhulen, beskadige det anaerobe miljø i tarmhulen og give et godt vækstmiljø for fakultativt anaerobe eller aerobe bakterier. Tidligere undersøgelser og nærværende arbejde viste ligeledes, at tarmpræparatet havde øget abundansen af Proteobacteria .

I denne undersøgelse fandt vi, at tarmpræparatet signifikant nedsatte fylaen Bacteroidetes og Firmicutes (figur 2), og indtagelse af probiotika havde lille effekt på fylum Firmicutes, mens det i høj grad øgede abundansen af Bacteroidetes (figur 4). Tidligere undersøgelser havde vist, at forøgelsen af Firmicutes’ og faldet i Bacteroidetes’ hyppighed var tæt forbundet med usunde forhold. Derfor kan stigningen af Firmicutes/Bacteroidetes udgøre en potentiel risiko for patienternes sundhed (20-22). I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at forholdet mellem Firmicutes/Bacteroidetes i CA-gruppen (3,08) var højere end i PA-gruppen (0,98), hvilket tyder på, at indtagelse af probiotika kunne reducere de potentielle sygdomsrisici ved tarmforberedelse. Desuden har menneskekroppen normalt ikke evnen til at nedbryde de fleste komplekse polysaccharider (hovedbestanddelen og den vigtigste næringskilde i vores daglige kost), før de når frem til tyktarmen, og Bacteroidetes spiller en afgørende rolle i nedbrydningen af komplekse polysaccharider af cellulose, pektin og xylan, hvilket kan hjælpe folk med at optage mere energi fra kosten (23). Desuden spiller butyrat produceret af Bacteroidetes en vigtig rolle i opretholdelsen af værtens tarmsundhed, udøver immunitet og anti-tumoreffekt (24).

På genusniveau reducerede tilskud af probiotika signifikant mængden af Acinetobacter, som er en almindelig aerob og gramnegativ bakterie i naturen, der tilhører en vital patogen, der forårsager hospitalsinfektion, især hos patienter med lavt immunforsvar (Acinetobacter baumannii) (25). Acinetobacter var blevet opført som det tredje hyppigste humane patogen på intensivafdelingen på sydkoreanske hospitaler, og dets iboende lægemiddelresistens over for en række antibiotika gjorde det til at opnå determinanter for lægemiddelresistens over for forskellige antibakterielle lægemidler (26). Desuden reducerede tarmpræparat niveauet af Bacteroides betydeligt, og probiotika genvandt tydeligvis dens overflod. Undersøgelser havde vist, at Bacteroides kan reducere tarmens iltniveau for at fremme væksten af strenge anaerobe bakterier (23), og nogle stammer af Bifidobacterium er blevet taget i brug som probiotika i fødevarer og medicin (10, 27). Bacteroides og Bifidobacterium kan etablere en stabil og langvarig kontakt med værten og gavne menneskekroppens sundhed, kan nedbryde kostfibre til kortkædede fedtsyrer (SCFA’er), som er energikilde for cellerne, fremmer barrierefunktionen og reducerer forekomsten af inflammatoriske reaktioner (28, 29).

I sidste ende sammenlignede vi den mikrobielle diversitet af CA og PA og fandt, at indtagelse af probiotika overvejende forbedrede overflod af gavnlige bakterier såsom Roseburia (hovedsagelig eller kun producerer butyrat, hvilket kan reducere niveauet af inflammation i det hele, især i blodet, yderligere reducere graden af åreforkalkning. Det forbliver lavere niveauer hos personer med hjerte-kar-sygdomme) (30, 31), Faecalibacterium (en symbiotisk bakterie, der findes i vid udstrækning i mave-tarmkanalen hos dyr og mennesker. Den var signifikant reduceret hos Crohn-patienter og kan muligvis anvendes som probiotikum til behandling af Crohns sygdom) (32-34) og Parabacteroides (kan modstå tarmbetændelse, de vigtigste metaboliske slutprodukter er gavnlig eddikesyre og bikseddikesyre, som er lavere end det normale interval i tarmkanalen hos patienter med colitis) (35-37) på slægtsniveau. Ikke desto mindre var forekomsten af skadelige bakterier som Streptococcus markant reduceret (figur 5 og 6). Streptococcus er et almindeligt opportunistisk patogen, herunder Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans og Streptococcus pneumoniae, som kan forårsage purulent inflammation, endokarditis og septikæmi, hvilket yderligere truer menneskers sundhed og liv (38, 39). Haenni et al. anførte, at på grund af den udbredte brug af tetracyklin-, makrolid- og lincosamid-antibiotika i den globale husdyrsektor er der opstået antibiotikaresistens hos Streptococcus zooepidermidis, hvilket har ført til behandlingssvigt (40, 41).

I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at oral probiotika lindrede den intestinale mikrobielle forstyrrelse forårsaget af tarmforberedelse, reducerede patogenerne af Proteobacteria (på phylum-niveau), Acinetobacter (på slægtsniveau) kraftigt, Streptococcus (på slægtsniveau) og forbedrede de probiotiske bakterier af Bacteroidetes (på phylumniveau), Bacteroides (på slægtsniveau), Roseburia (på slægtsniveau), Faecalibacterium (på slægtsniveau) og Parabacteroides (på slægtsniveau). Vi har derfor grund til at tro, at tilskud af probiotiske præparater vil fremskynde etableringen af tarmens mikrobielle balance efter tarmrensning, undertrykke væksten af skadelige bakterier og gavne opretholdelsen af tarmens sundhed.

Data Availability Statement

Datasættene genereret til denne undersøgelse kan findes i NCBI: GenBank-adgangskodenummer PRJNA597277.

Ethisk erklæring

Studierne, der involverer menneskelige deltagere, blev gennemgået og godkendt af institutionelle bedømmelsesudvalg ved det andet tilknyttede hospital ved Nanchang University (Nanchang, Kina). Projektet er også blevet registreret og godkendt af China Clinical Trial Registration Center (ChiCTR1900022539). Patienterne/deltagerne gav deres skriftlige informerede samtykke til at deltage i denne undersøgelse.

Author Contributions

TC og XD designede eksperimenterne, analyserede dataene og skrev manuskriptet. CZ, HT, RY, ZL, YH og KW udførte eksperimenterne. Alle forfattere diskuterede resultaterne og kommenterede det endelige manuskript.

Funding

Dette arbejde blev støttet af bevillinger fra National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81960103 til XD), Natural Science Foundation of Jiangxi-provinsen (Grant No. 20192ACBL20034 til ZL), Science and Technology Project of Jiangxi (Grant Nos. 20181BBG70028, 20181BCB24003 og 20194BCJ22032 til TC) og Jiangxi-provinsens dobbelte 10.000-plan til TC (innovation og teknologifaglige fagfolk som højtstående talent).

Interessekonflikter

Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført uden kommercielle eller finansielle relationer, der kunne opfattes som en potentiel interessekonflikt.