Både denatureret og indfødt BR kan binde til GroEL
Den centrale mekanisme for GroEL-aktivitet er dens evne til at genkende en bred vifte af polypeptider hovedsageligt gennem interaktioner mellem de hydrofobiske rester af substratet og helikserne H og I på GroEL’s apikale domæner (Fig. 1A) (Coyle et al. 1997). Her blev binding af både denatureret og native BR til GroEL først undersøgt ved isotermisk titreringskalorimetri (ITC), da hver tilstand har rigeligt med hydrofobiske overfladerester, der er let tilgængelige for GroEL. Som vist i fig. 2A giver titrering af GroEL med BR eksoterme titreringstermogrammer i begge tilfælde. Varmeændringerne skyldes specifikt binding af BR til GroEL, da efterfølgende injektion af BR i assaybufferne uden chaperonin giver flade termogrammer (supplerende fig. S1). Varmen af hver injektion vist i fig. 2A blev integreret, korrigeret med fortyndingsvarmen og blev plottet mod det molare forhold mellem BR: GroEL (fig. 2B). Varmeændringen passer til et sæt steder bindingsmodel (røde og blå kurver), hvilket giver en dissociationskonstant (Kd) nær 0,3 nmol/L for denatureret BR og nær 6,0 nmol/L for native BR, henholdsvis (tabel 1). Denatureringen af BR øgede således GroEL’s bindingsaffinitet for dette membranprotein med en størrelsesorden. På den anden side er bindingen af begge BR-prøver drevet af en gunstig enthalpiforandring (ΔH) og modsat af en negativ entropiforandring (ΔS); bindingsstoiometrien (N), der er bestemt i begge tilfælde, ligger tæt på enhed (tabel 1). Bindingen af den native BR er dog klart mindre enthalpisk med mindre entropikompensation.
BR-binding til GroEL vurderet ved ITC. A Titrering af GroEL med SDS-denatureret BR (dBR, rød) eller native BR (nBR. blå). Termogrammer blev optaget ved 20 °C med et MicroCal ITC200-instrument. B Varmeudveksling af hver injektion i A blev integreret og plottet mod det molære forhold BR:GroEL. Gennemstrekte linjer repræsenterer tilpasningen af data til en model med et enkelt sæt sites (alle sites er identiske og ækvivalente), og de opnåede termodynamiske parametre er anført i tabel 1
Den lågformede co-chaperonin GroES er en væsentlig komponent i GroEL-medieret proteinfoldning i bakterier, og er blevet vist, at den deler de samme bindingssteder på GroEL med substratet (Chen og Sigler 1999). Titrering af GroEL med denatureret BR i tilstedeværelse af GroES viser, at GroES har lille effekt på BR-binding (supplerende fig. S2 og tabel 1). Dette resultat kan forstås ved at tage Kd i betragtning, som for dannelsen af et GroEL/ES-kompleks tidligere blev bestemt til at være 3 μmol/L og er betydeligt højere end den for BR-GroEL-komplekset, der er bestemt her (Behlke et al. 1997). Dette tyder på en meget svagere interaktion mellem de to chaperoninproteiner og er derfor i overensstemmelse med den ubetydelige effekt. I tilstedeværelse af ATP, som regulerer bindings- og frigørelsescyklusserne for GroEL og GroES in vivo, ville affiniteten af GroEL/ES imidlertid stige med tre størrelsesordener (normalt Kd ~1 nmol/L) (Farr et al. 2000), hvilket teoretisk set ville være i stand til at konkurrere med BR-binding til GroEL. Virkningen af apoGroEL på BR-foldning og derefter den rolle, som GroES og ATP spiller i denne proces, blev efterfølgende undersøgt.
GroEL-GroES-systemet kan modulere BR-foldning i tilstedeværelse af DDM
En del af SDS-denatureret BR blev observeret til at genfolde sig, når den blev fortyndet med et overskud af opløsende detergent n-dodecyl-β-D-maltosid (DDM), hvilket blev afsløret ved at måle genoprettelsen af retinal absorption (supplerende fig. S3) (Booth 1997) (Booth 1997). Der kunne ikke påvises nogen væsentlig genopretning i assaybufferen uden detergent eller suppleret med GroEL alene. I tilstedeværelse af DDM viste tilføjelsen af GroEL imidlertid en tydelig effekt på BR-foldningen (supplerende Fig. S3). Hastighedskonstanten for den GroEL (0,15 μmol/L)-medierede foldning, som vurderet ved tilpasning med enkelt eksponentiel kinetik, blev vurderet til at være ~ to gange lavere end den spontane foldning. GroEL er kendt for typisk at forsinke foldningen af opløselige proteiner, som kan foldes effektivt i dets fravær. Dette er blevet forklaret ved en konkurrence mellem intramolekylær foldning og intermolekylær binding til GroEL (Gray og Fersht 1993; Itzhaki et al. 1995). Det forekommer helt plausibelt, at GroEL opfører sig på samme måde i forbindelse med genfoldning af denatureret BR. Da koncentrationen af GroEL blev øget til 0,30 μmol/L, ændrede den anslåede hastighedskonstant sig ikke tydeligt, mens foldningsudbyttet nåede et meget højere niveau end den spontane foldning efter 60 min (supplerende fig. S3). Disse data viser, at apoGroEL kan nedsætte BR-foldningshastigheden, men øge udbyttet af det foldede protein.
Da bakterieceller indeholder flere millimolars ATP, og under normale forhold er det relative molforhold mellem GroES og GroEL 1,9 og efter hedeslag 4,7 (Moparthi et al. 2013); GroEL vil sandsynligvis ikke forblive længe uden at binde ATP og GroES. I tilstedeværelse af ATP (blå i fig. 3A) var genoprettelsen af korrekt foldet BR betydeligt hurtigere og større sammenlignet med apoGroEL alene eller den spontane proces (rød og sort i fig. 3A). I modsætning hertil viste kombinationen af GroEL og GroES kun ringe effekt på hastigheden af den spontane foldning, men reducerede udbyttet i et vist omfang (Fig. 3A, cyan). Dette tyder på et samspil mellem GroEL og GroES uden krav om ATP, sandsynligvis induceret af BR bundet til GroEL, som til gengæld havde en negativ effekt på genvindingen af korrekt foldet protein. Når det komplette chaperoninsystem blev anvendt (Fig. 3A, grøn), blev der observeret maksimal hastighedsforøgelse, men foldningsudbyttet faldt mellem de to foregående tilfælde.
Tidsforløb af BR-foldning moduleret af ATP-afhængigt GroEL-GroES-system. A Genoprettelsen af foldet BR blev løbende overvåget med absorbans ved 554 nm. Der blev foretaget følgende tilsætninger: ingen (sort); 0,3 μmol/L GroEL (rød); 0,3 μmol/L GroEL og 5 mmol/L ATP (blå); 0,3 μmol/L GroEL og 0,6 μmol/L GroES (cyan); 0,3 μmol/L GroEL, 0,6 μmol/L GroES og 5 mmol/L ATP (grøn). B Net GroEL-medieret BR-foldning blev først udført; derefter blev prøven ved T = 60 min suppleret med kun ATP, med kun GroES eller med begge dele som angivet. C Til sammenligning med A blev virkningen af ikke-cyklende enkeltring-version (SR1) af GroEL på BR-foldning også analyseret. De anvendte koncentrationer af SR1, GroES og ATP var henholdsvis 0,6 μmol/L, 1,2 μmol/L og 5 mmol/L. D Virkningerne af GroEL/ES plus ATP på den native foldning af BR blev undersøgt ved at følge absorbansændringen ved 560 nm. De anvendte koncentrationer af chaperonin og nukleotid i B og D var de samme som i A. BR blev holdt på 2,4 μmol/L i alle eksperimenter. De blå og grønne linjer i A og den blå linje i C repræsenterer tilpasningen af dataene til trefaset eksponentiel ligning, mens de resterende linjer er tilpasningen med enkelt eksponentiel ligning. Alle linjerne i B og D er simple vejledninger for øjnene
Overstående resultater tyder på, at ATP og GroES kan påvirke den GroEL-medierede BR-foldning på forskellig vis. GroES-binding til GroEL er noget skadelig for foldningen, i modsætning til den velkendte positive rolle, som substratindkapsling i GroEL/ES-buret spiller for den assisterede foldning (Jewett og Shea 2010). Vi stillede dernæst spørgsmålstegn ved, hvordan denne negative effekt blev frembragt. Intrigant nok lettede GroES alene eller dens mobile loop-sekvens, gennem hvilken GroES binder til GroEL, også genoprettelsen af foldet BR (supplerende fig. S4). Desuden viste loop-sekvensen en effekt svarende til GroES i den GroEL-medierede foldning i fravær og tilstedeværelse af ATP (supplerende fig. S4). Selv om den ikke kan danne en forseglet kappe over GroEL’s centrale hulrum som GroES, hvilket indebærer et betydeligt bidrag fra loop-GroEL-interaktionen til foldningen. Det er bemærkelsesværdigt, at de hydrofobiske rester på GroEL’s apikale overflade, der er involveret i binding af GroES mobile loop, for det meste overlapper med dem, der er involveret i binding af substratproteinet (Motojima et al. 2000). Det er usandsynligt, at den hydrofobiske BR blev fortrængt og frigjort ind i det hydrofiliske GroEL/ES-bur af den mobile loop, især i betragtning af tilstedeværelsen af DDM-miceller uden for buret, hvilket yderligere ville favorisere foldningen eller solubiliseringen af BR. Som det er påvist for den assisterede foldning af flere opløselige proteiner (Motojima og Yoshida 2010), kan BR fortrinsvis indfanges nær GroEL/ES-grænsefladen og delvist rage ud til ydersiden, når hele systemet eller endog GroEL/ES alene blev anvendt i denne undersøgelse. En sådan interaktion kan forhindre BR i at få adgang til de gunstige DDM-miceller, hvilket resulterer i det reducerede foldningsudbytte, der er observeret med både GroES og dets mobile loop.
Derimod tyder nogle undersøgelser på, at ATP og GroES’ rolle kun er at dissociere klæbrige substrater (dvs. med en Kd i nmol/L-regionen, der er bestemt her), som begrænser den assisterede foldningshastighed eller endda hæmmer GroEL’s foldningsaktivitet, hvis de ikke fjernes (Priya et al. 2013). For at teste, om GroES og ATP viser en lignende effekt i assisteret BR-foldning, inkuberede vi først apoGroEL med denatureret BR i 60 min; derefter tilføjede vi GroEL eller/og ATP (Fig. 3B). Den efterfølgende tilsætning af en af komponenterne fremmede yderligere BR-foldning, men var mindre effektiv end den samtidige tilsætning af begge, hvilket viser synergisme mellem de to til at hjælpe den GroEL-medierede foldning. Anisotropimålinger med BR-transmembranpeptider, der blev anvendt som mimetik for denatureret BR for at omgå de komplikationer, der blev indført af den dynamiske natur af denatureret BR og af GroEL-BR-interaktioner, viste, at kun kombinationen af ATP og GroES var i stand til effektivt at adskille det præformede peptid-GroEL-kompleks (supplerende fig. S5). Det ser således ud til, at både GroES og ATP er nødvendige for at dissociere BR-konformere med høj affinitet og regenerere de fastlåste GroEL-bindingssteder (eller katalytiske).
For yderligere at undersøge virkningen af GroES og ATP på den GroEL-medierede BR-foldning anvendte vi en enkeltring GroEL-mutant (SR1), der danner et stabilt kompleks med GroES (Weissman et al. 1995), i modsætning til det cyklende GroEL-GroES-system. I lighed med vores observation med GroEL øgede ATP hastigheden og udbyttet af SR1-medieret foldning (blå i Fig. 3C), mens tilstedeværelsen af GroES reducerede begge aspekter betydeligt (cyan) i forhold til tilfældet med apoSR1 alene eller den spontane proces (rød eller sort). Da denatureret BR blev bestemt ved ITC til at binde til SR1 med en stoiometri nær enhed (supplerende Fig. S2), og SR1 anvendt var dobbelt så koncentreret som GroEL, spekulerer vi, at der blev dannet flere BR-SR1-komplekser end BR-GroEL, hvorved GroES udøvede større indflydelse på foldningen (cyan). Som forventet viste tilsætning af både ATP og GroES en ubetydelig virkning på BR-genoprettelse (grøn), hvilket kan tilskrives den irreversible binding af GroES til SR1 i tilstedeværelse af ATP (Weissman et al. 1995). Desuden indikerer dette resultat, at den maksimale hastighedsforøgelse, der er observeret med GroEL, skyldes ATP-regulerede flere cyklusser af binding og frigivelse af GroES.
GroEL alene eller i kombination med ATP eller/og GroES viste en ubetydelig indflydelse på strukturen af native BR solubiliseret med DDM (Fig. 3D), hvilket peger på en stærkere intramolekylær interaktion i det native protein end intermolekylær binding til GroEL. Således er den chaperonin-medierede overgang af BR fra den metastabil denaturerede tilstand til den native tilstand termodynamisk gunstig.
Evidens for både den chaperonin-medierede disaggregering og udfoldning
Måling af den spontane BR-foldning ved varierende koncentrationer viser, at aggregering kun resulterede i delvis genopretning af korrekt foldet BR, og den tilsyneladende hastighed var koncentrationsuafhængig, hvilket indebærer, at aggregering var irreversibel (supplerende Fig. S6). I fravær af det opløsende detergent DDM blev SDS-denatureret BR vurderet ved fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) til at have en diffusionskoefficient (~67 μm2/s) meget lavere end bundet til GroEL (~104 μm2/s) (Fig. 4). Dette afspejler, at aggregaterne dannet af den denaturerede BR er endnu større end BR-GroEL-komplekset med en bindingsstofiometri tæt på enhed som bestemt ved ITC. Dette betyder også, at GroEL var i stand til at forstyrre aggregationsstrukturen og i det væsentlige pumpe den produktive foldningsvej med monomerisk BR. Desuden blev nBR solubiliseret med DDM bestemt til at have en diffusionskoefficient på ~117 μm2/s, hvilket er større end for dBR med GroEL og meget større end for dBR alene (Fig. 4). Dette tyder på, at nBR var godt dispergeret i tilstedeværelsen af DDM og understøtter også ideen om GroEL-medieret disaggregering af dBR. Når det komplette chaperoninsystem blev tilsat til denatureret BR, var der desuden straks hvide flockulente udfældninger synlige (data ikke vist), hvilket indikerer tvungen udfoldning samt synergisme mellem GroES og ATP i dette aspekt. Uden opløsende detergenter eller lipider, der efterligner biologiske membraner i bulkopløsningen, ville udfoldet BR øjeblikkeligt aggregere og udfælde, i modsætning til den betydelige foldningshastighedsforøgelse, der blev observeret i tilstedeværelse af DDM.
FCS-måling af denatureret BR i fravær eller tilstedeværelse af GroEL sammenlignet med native BR. Fluorescensautokorrelationsamplituder G(τ) af Alexa Fluor 488-fluorescens blev vist for SDS-denatureret BR alene eller med et overskud af GroEL i fravær af solubiliserende detergent eller native BR solubiliseret med DDM. Diffusionskoefficienter (D) blev opnået ved at tilpasse auto-korrelationskurven med Eq. 1. Standardafvigelser var fra tre uafhængige målinger
Membranindsættelse af BR medieret af GroEL-GroES
For at bestemme, om eller hvordan GroEL-GroES ville understøtte integration af BR i bilaget, blev inverterede cytoplasmiske membranvesikler (IMV’er) fremstillet fra Escherichia. coli-celler og blandet med denatureret BR i tilstedeværelse og fravær af apoGroEL eller plus ATP/GroES (Fig. 5A). ApoGroEL forårsagede en ubetydelig ændring i genoprettelsen af korrekt foldet BR i IMV’er, som målt ved UV-Vis-spektroskopi (sort og rød). I modsætning til genfoldningen i DDM-miceller viste det sig, at tilsætning af GroEL og ATP var skadelig for membranindsættelsen (blå), mens GroEL kombineret med GroES lettede denne proces (cyan). Den egentlige årsag til denne reproducerbare forskel kendes ikke, men IMV’ernes stivhed og den strukturelle ændring af GroEL-bundet BR, der induceres af ATP- eller GroES-binding, kan være mulige årsager. Specifikt er det kendt, at ATP-binding af GroEL forårsager en udvidelse af åbningen til hulrummet af chaperoninet (Skjaerven et al. 2015). Denne ændring er mere mærkbar end den, der forårsages af blot GroES-binding til GroEL (Kim et al. 2005), og muliggør således muligvis udfoldning af det bundne substrat (Lin et al. 2008; Sharma et al. 2008), hvilket er gunstigt for produktiv foldning i et passende opløsningsmiddel. I modsætning til DDM-miceller, der er meget dynamiske, var IMV’er imidlertid sandsynligvis ikke i stand til hurtigt at beskytte de udfoldede BR-arter og rettidigt at skabe et fordelagtigt mikromiljø for foldning. Til sammenligning kan den svage tilknytning af GroES til GroEL i mangel af ATP måske levere BR til de fremstillede IMV’er på en mere effektiv måde. I lighed med genfoldningen i DDM-miceller forbedrede det komplette GroEL-GroES-system imidlertid i høj grad membranindsættelsen af BR (grøn), som hurtigt nåede en stabil tilstand med mængden af genvundet BR, der faldt mellem de to foregående tilfælde.
Indsættelse af BR i IMV’er formidlet af GroEL-GroES-systemet. A Indsættelse og/eller omfoldning af denatureret BR (2,4 μmol/L) i IMV’er blev løbende overvåget med absorbans ved 554 nm. Der blev foretaget følgende tilsætninger: ingen (sort); 0,3 μmol/L GroEL (rød); 0,3 μmol/L GroEL og 5 mmol/L ATP (blå); 0,3 μmol/L GroEL og 0,6 μmol/L GroES (cyan); 0,3 μmol/L GroEL, 0,6 μmol/L GroES og 5 mmol/L ATP (grøn). B Native BR kan overføres effektivt til IMV’er i tilstedeværelse af GroEL ved hjælp af ATP og GroES. De testede koncentrationer af native BR, GroEL, GroES og ATP var henholdsvis 0,4, 5, 10 μmol/L og 5 mmol/L
Næst blev fluorescensanisotropi anvendt til at undersøge virkningerne af de bakterielle chaperoniner på indsættelsen af BR i IMV’er (fig. 5B). Når fluorescerende mærket native BR blev blandet med en overdreven mængde GroEL, skiftede anisotropien til en højere værdi, hvilket viste, at membranproteinet dannede et stabilt kompleks med chaperoninet. Det er vigtigt at bemærke, at den efterfølgende tilsætning af IMV’er førte til en yderligere stigning i anisotropien, hvilket indikerer integrationen af BR i IMV’er. ATP og GroES viste sig at øge overførslen af BR ind i membranen yderligere, hvilket også blev vurderet ud fra stigningen i anisotropi. Disse resultater giver mulighed for, at GroEL sammen med GroES og ATP kan have en direkte rolle i integrationen af proteiner i lipiddilaget in vivo.