Klinisk og genetisk heterogenitet af 15q13.3 mikrodeletionssyndromet

Abstract

Mikrodeletionen 15q13.3 er en tilbagevendende CNV, der formodentlig formidles af NAHR mellem segmentale duplikationer i kromosom 15. 15q13.3-deletionen og duplikationen er forbundet med en lang række kliniske manifestationer, såsom intellektuelle underskud, kramper, autisme, sprog- og udviklingsforsinkelse, neuropsykiatriske forringelser og adfærdsproblemer, der illustrerer ufuldstændig penetrering og ekspressivitet. Denne undersøgelse omfatter en evaluering af 106 symptomatiske patienter, der bærer den heterozygote deletion, samt af 21 patienter, der bærer duplikationen, som er blevet beskrevet i tidligere undersøgelser. Analysen viser betydelig heterogenitet med hensyn til manifestationen af forskellige nøglesymptomer og velkendt forekomst. Desuden introduceres 8 nye patienter. Konvolverede kendte forbindelser giver ny indsigt i kompleksiteten af symptomatisk manifestation. I tidligere undersøgelser er der blevet udtrykt forskellige meninger om karakteren og den præcise placering af deletionsbrudpunkterne. Her viser vi, at det ikke er CHRNA7 og CHRFAM7A, men snarere FAM7A eller GOLGA8, der fungerer som breakpoint-regioner vedrørende vores patienter. Deletionen beskrives som heterogen i størrelse. Vi antager imidlertid, at ikke kun forskellige breakpoints, men også upræcisionen af aCGH-analysen på kromosom 15 på grund af segmentale duplikationer er årsag til variationen i størrelse.

© 2016 S. Karger AG, Basel

Det 15q13.3 mikrodeletionssyndrom (OMIM 612002), som først blev beskrevet af Sharp et al. , er en tilbagevendende CNV, der formodentlig formidles af NAHR mellem segmentale duplikationer (BP3-BP5, BP4-BP5) i kromosom 15. 15q13.3-deletionen og -duplikationen er forbundet med en lang række neuroudviklingsforstyrrelser, såsom intellektuelle underskud, kramper, autisme, sprog- og udviklingsforsinkelse, neuropsykiatriske forstyrrelser og adfærdsproblemer med ufuldstændig penetrering og variabel ekspressivitet. Den typiske 1,6 Mb-deletion indeholder 7 gener: ARHGAP11B, MTMR10, MTMR 15, TRPM1, KLF13, OTUD7A og CHRNA7. CHRNA7 koder for den neuronale alpha7 nikotinacetylcholinreceptor og betragtes derfor som det vigtigste kandidatgen, der er ansvarlig for de kliniske træk, der kommer til udtryk.

I denne undersøgelse beskriver vi 6 hidtil upublicerede patienter, der bærer den typiske 15q13.3-mikrodeletion mellem BP4 og BP5, herunder en familie med 4 berørte medlemmer, som beskrives yderligere nedenfor. Desuden beskrives 1 patient med en 15q13.3-duplikation og 1 patient med en 3,4 Mb-deletion mellem BP3 og BP5.

For at forklare de mange forskellige kliniske manifestationer og symptomernes sværhedsgrad gennemgik vi desuden dataene fra 106 symptomatiske patienter med heterozygote 15q13.3-deletion og 21 patienter med duplikationer, som er blevet rapporteret.

I de seneste undersøgelser er der opstået forskellige meninger om karakteren og den præcise placering af deletionsbrudpunkterne. Vi undersøgte brudpunktets placering ved hjælp af FISH for at bekræfte, i hvor høj grad disse muligheder viser sig at være sande for vores patienter.

Metoder

DNA-udtrækning og Array CGH

Perifere blodleukocytter blev anvendt som kilde til DNA. Array-CGH-analysen blev udført ved hjælp af en array slide Sure Print 4x180K (Agilent Technologies, Santa Clara, Calif., USA). Patient-DNA blev mærket med Cy3, reference-DNA med Cy5. Hybridisering blev udført ved hjælp af Cot-1 DNA (1,0 µg/ml). Test-DNA-prøver blev hybridiseret med kønsmatchet reference-DNA (Agilent). Rensning, hybridisering og vasketrin blev udført i overensstemmelse med producentens anvisninger. Der blev anvendt Sure Scan microarray Scanner G2600D (Agilent), Feature Extraction software (Agilent) og Agilent Cytogenomics Software Edition 2.0.6.0.

FISH og Breakpoint Analysis

Slides med metaphaser af dyrkede perifere lymfocytter var blevet opbevaret ved -70°C. Før hybridisering blev objektglassene behandlet i en alkoholserie (70, 80 og 100%) efterfulgt af pepsinbehandling (15 min, 37°C). Fluorescensmærkede BAC’er (Illumina®, BlueFish) blev anvendt som FISH-sonder. Sondeforberedelse, hybridisering og vasketrin blev udført i henhold til Illuminas instruktioner.

De anvendte BAC-sonder var RP11-11H9, 22,067,176-22,300,706, chr.15q11.2; RP11-40J8, 30,546,758-30,724,265, chr.15q13.2; RP11-348B17, 31,281,641-31,502,115, chr.15q.13.3; RP11-265I17, 32,293,149-32,457,541, chr.15q13.3; RP11-280K19, 32,654,212-32,821,799, chr.15q13.3, og RP11-232J12, 53,792,861-53,948,902, chr.15q21.3 (se fig. 1, hg19).

Resultater

Klinisk vurdering

Patienterne blev oprindeligt observeret i forbindelse med neuropædiatrisk undersøgelse på grund af intellektuelle underskud og/eller udviklingsforsinkelse. Tabel 1 opsummerer de cytogenetiske og kliniske fund.

Beskrivelse af patienterne

Patient 1 (III/1)

Den 13-årige pige præsenterede sig med opmærksomhedsunderskud og hyperaktivitetsforstyrrelse (ADHD), intellektuelle underskud, udviklingsforsinkelse, tilbagevendende luftvejsinfektioner og skoliose. Hendes vægt og hovedomkreds (OFC) varierer omkring den 10. percentil (P), henholdsvis P90. Hun går på en specialskole. Hendes mor (II/2, i fig. 2) har også gået på en skole for specialundervisning og har afsluttet den med succes. Begge forældre har ikke været til rådighed for yderligere undersøgelser. Patient 1 er halvsøster til patienterne 2 og 3 og kusine til patient 4.

Patient 2 (III/2)

Den kvindelige patient blev introduceret i en alder af 9 år og viste udviklings- og sprogforsinkelse samt intellektuelle mangler (K-ABC-test: IQ 63). Et vågent EEG viste generelle forandringer, men indtil videre er der ikke forekommet nogen anfald. Hendes OFC ligger mellem P3 og P10, vægt og højde er inden for normalområdet. ADHD behandles med methylphenidat. Hun beskrives som en munter, men også aggressiv og impulsiv person og går på en specialskole. Begge forældre har ikke været tilgængelige for yderligere udredning.

Patient 3 (III/3)

Den 10-årige patient blev diagnosticeret med en indlæringsforstyrrelse, som ikke blev nærmere defineret. Pigens kropsmål viser en stor variation over tid. Indtil hun var 2 år gammel, var hendes OFC P<3; i øjeblikket er hendes vægt P97. Hun er overvægtig, viser stereotyp adfærd og går på en specialskole.

Patient 4 (III/6)

Undersøgelsen af patienten (13 år gammel) afslørede sproglig og psykomotorisk forsinkelse samt lette intellektuelle mangler (HAWIK-IV: SW 56). Bemærkelsesværdige træk er multiple dyslalia og ADHD, som behandles med methylphenidat (10-15 mg/dag). Drengens EEG er ubeskriveligt, hans OFC er normal, hans højde P90 og hans vægt P97. Patientens karakter beskrives som venlig, men til tider aggressiv og impulsiv. Han går på en skole for handicappede. Begge forældre har gået på en specialskole. Hans far (II/5) er fængslet for overfald. Hans 2 søstre (III/7, III/8) besøger også en specialskole, og hans halvbror (III/9) viser en forsinkelse i udvikling og sprog, men bærer ikke deletionen. Patienten er fætter til patient 1, 2 og 3. Forældrene har ikke været tilgængelige for undersøgelse.

Patient 5

Patienten (14 år gammel) præsenterede sig med unormal social adfærd og ADHD. På grund af hans dårlige skolepræstationer og uoverensstemmelsen mellem hans intellektuelle præstationer (HAMIK-IV, IQ 78) og familiens gennemsnit blev der iværksat en lægeundersøgelse. Efter et epileptisk anfald er han blevet behandlet med succes med Orfiril®. ADHD behandles med methylphenidat (5-10 mg/dag). Hans forældre har ikke været tilgængelige for undersøgelse.

Patient 6

Som spædbarn udviste patient 6 udviklings- og sprogforsinkelse. Han viste tegn på hypotoni. På undersøgelsestidspunktet præsenterede den 19-årige patient sig med intellektuelle underskud og ADHD. Behandlingen med methylphenidat blev stoppet, efter at patienten begyndte at dyrke højtydende sport, hvilket viste sig at være en effektiv behandling af ADHD-symptomerne. Hans mor er ikke en deletionsbærer. Hans far har ikke været tilgængelig til undersøgelse.

Patient 7

Patienten blev undersøgt i en alder af 7 år og viste milde intellektuelle underskud (K-ABC-Test, SW: 63). Hans kropsmål er alle inden for P10. Han beskrives som rastløs og uopmærksom. Han går i en specialskole. Hans forældre har ikke været tilgængelige for undersøgelse.

Patient 8

Patienten blev født med en hjertefejl (ventrikelseptumdefekt og atrieseptumdefekt). Han viser dysmorfiske træk som f.eks. lavtsiddende ører, hypertelorisme, strabisme og hypotoni. Hans psykomotoriske udvikling er forsinket. Patientens fødselslængde og OFC var P50, og hans vægt var P10. Han har arvet duplikationen fra sin far, som viser en ubeskrivelig fænotype. Der er rapporteret om en onkel (på moderens side) med epilepsi og malign hypertermi.

Brydepunktsanalyse

I tidligere undersøgelser har heterogeniteten af deletionsstørrelsen været et emne af interesse. Shinawi et al. antog, at FAM7A1/2 fungerede som et brudpunkt, mens Szafranski et al. mistænkte CHRNA7 og CHRFAM7A for at være ansvarlige for den tilbagevendende deletion i locus 15q13.3. Antonacci et al. foreslog genfamilien GOLGA8 som mulige kandidater. Der blev gjort et forsøg på at validere disse teorier ved hjælp af FISH. Sonde 4 markerer CHRNA7, sonde 5 markerer FAM7A, sonde 2 markerer CHRFAM7A, og sonde 3 markerer et område distalt fra CHRFAM7A (fig. 1). Hos vores patienter kan FAM7A påvises i begge kromosomer 15. Dette resultat indikerer, at det distale brudpunkt er placeret mellem CHRNA7 og FAM7A. Analysen af patienterne 7 og 4 viser, at det proximale brudpunkt er placeret distalt i forhold til CHRFAM7A (fig. 3, 4). Hos patient 7 overbygger sonde 3 brudpunktet. Derfor medierer CHRNA7 og CHRFAM7A ikke den tilbagevendende deletion vedrørende vores patienter.

Evaluering af symptomatiske patienter beskrevet i tidligere undersøgelser

For patienter og undersøgelser se tabel 2 og online supplerende materiale 1 (for alt online suppl. materiale, se www.karger.com/doi/10.1159/000443343). Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Fisher’s eksakte test ved hjælp af softwaren ‘R’. Resultater med p < 0,05 blev vurderet som signifikante.

Discussion

Den familie, vi præsenterer, viser interessante træk. På den ene side varierer graden af slægtskab; på den anden side er symptomerne også forskellige (fig. 2). Der er imidlertid ingen påviselig sammenhæng mellem graden af slægtskab og symptomer. Patienterne 2 og 3, som er søstre, er bemærkelsesværdigt forskellige. De varierer betydeligt i kropsmål, karakter og symptomernes sværhedsgrad, selv om de er udsat for lignende miljøfaktorer og bærer den samme deletionsstørrelse. Derfor vil andre genetiske faktorer nødvendigvis påvirke graden af kliniske manifestationer. En mulig forklaring kunne være et ændret udtryk af hendes gener i genomet, som kan have forskellige virkninger . Denne tilgang er blevet yderligere bekræftet af Henrichsen et al. , som har vist, at CNV-regioner udtrykkes på lavere og mere varierende niveauer og ændrer ekspressionen af nabogenerne. Chaignat et al. anførte, at CNV’er ændrer ekspressionstidspunktet for gener under udviklingen hos mus. Desuden kan der findes forskellige tidsmønstre for ekspression hos forskellige individer. Desuden kan ændret ekspression eller mutationer af forskellige gener, der koder for forskellige trin i den samme neurobiologiske vej, forstærke neurologiske symptomer. Poot et al. foreslår forskellige mekanismer, som kan føre til fænotypisk pleiotropi af CNV’er, f.eks. interaktion af CNV’er, genetisk epistase eller allelisk udelukkelse.

Tre ud af 4 familiemedlemmer manifesterer ADHD; alle viser udviklingsforsinkelse. Da oprindelsen af ADHD tilsyneladende er multifaktoriel, er det ikke overraskende at finde en ophobning i en familie. Det er bemærkelsesværdigt, at alle børn er påvirket af deletionen. Særlige familiære genetiske konstellationer øger muligvis sandsynligheden for at manifestere symptomer. Desuden kan de intrauterine omgivelser, som den mor, der bærer en deletion, har haft, have påvirket hendes børns fænotype. Der kunne imidlertid ikke identificeres nogen fælles CNV’er, der korrelerer med forekomsten af symptomer, og der kunne ikke identificeres en anden patogen CNV hos nogen af vores patienter.

Brudpunktsanalysen viser, at det distale brudpunkt er placeret distalt i forhold til CHRNA7. Mulige placeringer ville være inden for genfamilierne FAM7A eller GOLGA8, som det allerede er blevet foreslået, eller inden for locus kontrolregionerne . Det proximale brudpunkt er placeret distalt i forhold til CHRFAM7A. Hos patienterne 1-4, som tilhører én familie, er der forskel på de deletionsstørrelser, der er påvist af aCGH-analysesoftwaren. Disse forskelle skyldes huller i fordelingsmønstret af oligonukleotider i aCGH’en inden for og omkring breakpoint-regionerne. Små ændringer i log-forholdet af marginalt placerede oligonukleotider resulterer i en betydelig forskydning af den deletionsstørrelse, der er påvist af analysesoftwaren. Den tydelige forskel i størrelsen af den tilbagevendende deletion 15q13.3 er højst sandsynligt en artefakt fra behandlingssoftwaren. Vi antager, at deletionen er identisk i størrelse for alle familiemedlemmer (se online suppl. materiale 2).

Differente CNV-undersøgelser har afsløret en association af 15q13.3-mikrodeletion med skizofreni, epilepsi og autisme. Der er udkommet adskillige publikationer med nye tilfælde og teorier om brudpunkter og faktorer, der ændrer symptomerne . Man har bestræbt sig på at sammenlægge disse oplysninger for at finde nye sammenhænge.

Resultaterne giver plads til spekulationer. Deletioner nedarves i 80,88%. Maternal decent er beskrevet uforholdsmæssigt oftere for deletioner (54.41%, p = 0.001) og duplikationer (53.33%, p = 0.027).

En forklaring kan gives af Sinkus et al. .De undersøgte virkningen af CHRNA7 promotorpolymorfismer, som nedsætter transkriptionsniveauet med ∼25% og påvirker kortisolniveauet hos mor og barn. Kortisolniveauet hos barnet sænkes yderligere, hvis både moderen og barnet er polymorfismebærere. Indvirkningen af den intrauterine omgivelse kan også have indflydelse på andre faktorer. OFC er reduceret hos patienterne, hvis deletionen er nedarvet af moderen (P<25 i 50 %, p = 0,002). Derfor antager vi, at hvis aberrationen er arvet fra moderen, vil den intrauterine omgivelse forstærke symptomerne. Da vi kun inkluderede symptomatiske patienter i denne vurdering, ville dette forklare, hvorfor størstedelen af aberrationerne tilsyneladende er af moderlig oprindelse (54 %, p = 0,001). I denne sammenhæng er det påfaldende, at kønsfordelingen af deletionen er lige stor. Vores data bekræfter resultaterne fra Lowther et al. . I deres omfattende gennemgang af 15q13.3-deletionen kombinerede de symptomatiske og asymptomatiske patienter. Da vi kun inkluderede symptomatiske patienter, er proportionerne af fordelingsmønstre af træk ens, men de relative antal er forskellige. Med hensyn til den øgede moderlige anstændighed af deletioner angiver de en nedsat reproduktiv fitness hos hanner som en mulig forklaring.

Deletionens størrelse korrelerer ikke konsekvent med graden af symptomer. For eksempel viser en sammenligning af graden af intellektuelle mangler med størrelsen af deletionen ingen lineær sammenhæng. Patienter med den typiske 1,6 Mb-deletion udviser oftere alvorlige underskud end patienter med mindre eller større deletioner (41,07 %, p = 0,00045). Intellektuelle underskud rapporteres betydeligt oftere hos patienter med deletioner end hos patienter med duplikeringer (79,78 % og 55,56 %, p = 0,037). Som forventet beskrives normal intelligens hyppigst hos patienter med deletioner <1 Mb (45 %, p = 0,0037).

Deletioner med en størrelse på 1-1,6 Mb er hyppigst (63,21 %, p = 0,0002). Duplikationer <1 Mb (66,67 %, p = 0,0004) er hyppigst beskrevet. Med hensyn til deletioner beskrives intellektuelle underskud (79,78 %), sprogforstyrrelser (75,34 %), en mærkbar fænotype hos forældrene (66,67 %) og adfærdsproblemer (63,64 %) langt oftere end epilepsi (30,61 %) eller autisme (27,71 %) (p = 0,02-3,931E-09). Sammenligner man duplikationer og deletioner, er duplikationer oftere forbundet med autisme (p = 0,039), og forældrenes fænotype er markant mindre hyppig (p = 0,027).

Epilepsi er signifikant forbundet med lette intellektuelle underskud (59,09 %, p = 0,0029). Sprogforstyrrelser er forbundet med intellektuelle underskud i 79,24% af tilfældene (p = 0,003).

Sammenfattende kan det siges, at den kliniske fænotype af mikrodeletion 15q13.3 er af multifaktoriel oprindelse. Selv nære familiemedlemmer, der er udsat for lignende miljøfaktorer, adskiller sig betydeligt i deres kliniske manifestationer. Genetisk rådgivning i familier med 15q13.3-mikrodeletioner eller især mikroduplikationer er derfor fortsat kompleks og undertiden utilstrækkelig. Yderligere undersøgelser af genetiske forandringer vedrørende den ikke-deleterede allel eller promotorregioner af berørte gener kan være mere lovende, når det drejer sig om at opdage indflydelsesfaktorer.

Anerkendelser

Forfatterne takker Margot Fliegauf, Monika Heinkelein, Helga Heitzler og Claudia Ladwig i den cytogenetiske gruppe på Institut for Humangenetik i Freiburg for deres eksperimentelle rådgivning og bistand. Vi takker også Ekkehart Lausch, Elke Botzenhart, Susanne Munk-Schulenburg og Andreas Busche for patientpleje. Vi er taknemmelige over for patienterne og deres familier for deres venlige samarbejde.

Etiske erklæringer

Forfatterne har ingen etiske konflikter at oplyse.

Oplysningserklæring

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Author Contacts

Artikel/publikationsdetaljer

Copyright / Lægemiddeldosering / Ansvarsfraskrivelse

Copyright: Alle rettigheder forbeholdes. Ingen del af denne publikation må oversættes til andre sprog, reproduceres eller udnyttes i nogen form eller på nogen måde, elektronisk eller mekanisk, herunder fotokopiering, optagelse, mikrokopiering eller ved hjælp af et informationslagrings- og informationssøgningssystem, uden skriftlig tilladelse fra udgiveren.
Drug Dosering: Forfatterne og udgiveren har gjort deres yderste for at sikre, at valg og dosering af lægemidler i denne tekst er i overensstemmelse med gældende anbefalinger og praksis på udgivelsestidspunktet. I betragtning af den igangværende forskning, ændringer i statslige bestemmelser og den konstante strøm af oplysninger om lægemiddelbehandling og lægemiddelreaktioner opfordres læseren imidlertid til at kontrollere indlægssedlen for hvert enkelt lægemiddel for eventuelle ændringer i indikationer og dosering og for tilføjede advarsler og forsigtighedsregler. Dette er især vigtigt, når det anbefalede middel er et nyt og/eller sjældent anvendt lægemiddel.
Disclaimer: De udtalelser, meninger og data, der er indeholdt i denne publikation, tilhører udelukkende de enkelte forfattere og bidragydere og ikke udgiverne og redaktøren/redaktørerne. Forekomsten af reklamer og/eller produktreferencer i publikationen er ikke en garanti, godkendelse eller godkendelse af de produkter eller tjenester, der reklameres for, eller af deres effektivitet, kvalitet eller sikkerhed. Udgiveren og redaktøren/redaktørerne fraskriver sig ansvaret for eventuelle skader på personer eller ejendom som følge af ideer, metoder, instruktioner eller produkter, der henvises til i indholdet eller annoncerne.