Klonogene assay: hvad, hvorfor og hvordan

Et klonogene assay, også kendt som et koloni-dannelsesassay

er et in vitro celleoverlevelsesassay. Den vurderer de enkelte cellers evne til at overleve og reproducere sig for at danne kolonier.1 Denne test blev først beskrevet i 1950’erne, hvor den blev brugt til at undersøge virkningerne af stråling på kræftcellers overlevelse og vækst, og den har efterfølgende spillet en væsentlig rolle i radiobiologien.2

For at måle klonogenicitet skal cellerne udsås ved meget lave tætheder og efterlades i en periode på 1-3 uger, så der kan dannes kolonier. Kolonierne fikseres derefter, farves med krystalviolet for at gøre dem synlige og tælles. Celleoverlevelseskurver tegnes for at analysere dataene. I dag bruges klonogene assays til at besvare en række eksperimentelle spørgsmål, især inden for kræftbiologi.

Denne blog fremhæver:

Hvordan man udfører et klonogene assay med vigtige overvejelser at gøre undervejs

Anvendelse af labelfri mikroskopi og konfluensdetektion til at vurdere koloniantal og -størrelse ved hjælp af automatiseret billedkvantificering

Det klonogene overlevelsesassay

Klonogene assays anvendes i vid udstrækning inden for kræftforskning, da dannelsen af kloner fortolkes som et træk ved kræftceller med tumorinitierende evner. Selv om dette forsøg oprindeligt blev anvendt inden for radiobiologi, er det blevet et standardværktøj inden for kræftforskning til at evaluere cellevækst og de cytotoksiske eller genotoksiske virkninger af forskellige stoffer med potentiel klinisk anvendelse. Dette omfatter kemoterapeutiske midler og målrettede terapier alene eller i kombination 3.

Clonogen vækst anvendes også til at evaluere stammeevnen i bestemte cellepopulationer, da stamceller er langlivede celler med potentiale til fortsat proliferation. Dette er særlig relevant for kræftforskning, da kræftstamceller ofte er forbundet med kemoresistens, dannelse af sekundære tumorer og tilbagefald af kræft. Derfor er undersøgelse af kræftstamceller ved hjælp af et klonogene assay et værdifuldt og meget anvendt redskab til at forudsige effektiviteten af en bestemt behandling.4

Klonogene assays måler cellernes evne til at bevare deres reproduktive integritet over en længere periode. Dette er en vigtig egenskab, da det afslører fænotypiske virkninger, der kræver tid og muligvis flere celledelinger for at udvikle sig. Ved analyse af terapeutisk resistens er dette særlig vigtigt. Lægemiddelresistens kan ikke identificeres ved hjælp af kortvarige cytotoksicitetsanalyser.5

Sådan udføres et klonogene assay

Informationerne i dette afsnit er tilpasset fra Franken et al. (2006), som har offentliggjort en protokol til klonogene assays i Nature Protocols1 , kombineret med nogle indsigter fra min egen erfaring fra udførelsen af over 60 klonogene assays i løbet af min ph.d.-grad.

Der er i princippet to forskellige måder at udføre et klonogene assay på:

(1) Celler kan udsås ved lave tætheder og derefter behandles for at undersøge effekten af behandlingen på cellernes klonogenicitet.

(2) Celler kan behandles i en bestemt periode og derefter genudplantes ved lave tætheder i behandlingsfri medier for at teste klonogen evne.

Dette sidste anvendes ofte til at vurdere terapeutisk resistens efter behandling. Figur 1 opsummerer den første fremgangsmåde, som er den traditionelle metode til at udføre et klonogene assay. Som det vil fremgå, er dette en tidskrævende metode, der ikke giver nogen oplysninger om forsøgets forløb (kun slutpunkt). Vi vil senere diskutere automatiserede og alternative metoder uden endpoint.

Traditionel protokol for klonogene assays

Figur. 1 | Et resumé af en traditionel klonogen protokol, hvor cellerne udsås, behandles og derefter klonogeniciteten vurderes.

Clonogene assays udføres typisk i 6-well- eller 24-well-plader. Cellerne skal udplottes sparsomt og jævnt, så der kan dannes isolerede kolonier. Derfor er det vigtigt at optimere din seedningstæthed for den valgte brøndstørrelse, inden du udfører dit klonogene assay.

Et godt udgangspunkt er at kigge i litteraturen for at se, om der er udført undersøgelser af klonogene assays med din cellelinje, og derefter teste denne seedningstæthed og to eller tre andre. Under denne optimeringsproces er det også vigtigt at overveje dit eksperimentelle slutpunkt (f.eks. 7 dage, 14 dage eller 21 dage) og cellevæksthastigheden, da du ikke ønsker sammenblanding af kolonier, hvilket vil forstyrre kolonikvantificering og -analyse. Udplantningstætheden bør være den samme for alle behandlingsbetingelser i dit forsøg.
Anvendelse af de rigtige kontroller er afgørende for analysefasen. Man bør altid bruge en ubehandlet kontrol samt en kontrol, der kun indeholder et medium (dette kan være DMSO, PBS eller et andet opløsningsmiddel, som din behandling er opløst i). For behandlingsbetingelser anvendes ofte en fortyndingsserie. Behandlingsperioden og behandlingens hårdhed vil være med til at bestemme koncentrationsområdet – dette vil sandsynligvis kræve en vis optimering. Hver kontrol- og forsøgsbetingelse bør udføres i tre eksemplarer.

I koloniopbygningsfasen skal du overvåge kolonivæksten under alle behandlingsbetingelser. En koloni anses for at være 50 celler eller mere, og de er kun synlige under et mikroskop. Da dette assay typisk er over en lang periode, skal du skifte dit cellemedie. Cellerne vil til at begynde med have en meget lav konfluens, så du behøver ikke at skifte medierne så regelmæssigt som normalt. Men hvis du udsætter og derefter behandler med et lægemiddel eller et stof, er det vigtigt at tage hensyn til dets halveringstid og tilføje ny behandling efter behov.

For forskere, der er interesserede i at afbilde koloniens vækst over tid. Vi anbefaler at kigge på CytoSMART Omni.

—————–

Det er ofte kolonierne under kontrolbetingelserne, der vokser hurtigst, og derfor kan du bruge disse celler som en indikation af dit eksperimentelle slutpunkt, dvs. afslut eksperimentet, før dine kolonier begynder at smelte sammen, og hvis dette sker for hurtigt, skal du hellere bruge en lavere seedningstæthed til dit eksperiment. Det er vigtigt at afslutte forsøget for alle behandlingsbetingelser på samme tid.

Når du har nået dit eksperimentelle slutpunkt, skal cellerne vaskes forsigtigt med PBS (tilsæt PBS til siden af brønden for ikke at forstyrre kolonierne), fikseres og farves med det DNA-interkalerende farvestof, crystal violet (0,5 % w/v) i mindst 30 minutter. Det kan være uhensigtsmæssigt at fjerne det overskydende farvestof. Den bedste teknik er at dyppe pladerne forsigtigt i bægerglas nedsænket i vand, indtil alt overskydende farvestof er fjernet, og der kun er tilbage med lyslilla kolonier. De farvede kolonier kan tælles op til 50 uger efter farvningen. Tag billeder i høj opløsning af dine brønde til brug for analyser, præsentationer og publikationsfigurer.

For at støtte forskere i analyse og optimering af deres koloni-dannelsesassays har CytoSMART introduceret en applikation til CytoSMART Omni til at detektere kolonier i (time-lapse) billeder af hele brøndplader ved 10X forstørrelse. I inkubator kan time-lapse-billeddannelse give kinetiske oplysninger i stedet for slutpunkt, hvilket kan give mere detaljerede oplysninger om, hvornår behandlingen begynder at påvirke cellerne. Etiketfri billedanalyse anvendes til at påvise kolonier og vurdere deres størrelse og cirkularitet. Det er muligt at finde ud af, hvornår kolonierne begynder at smelte sammen, og at optimere i overensstemmelse hermed.

Sådan analyserer du dit klonogene assay

Det er virkelig så enkelt som at tælle dine kolonier manuelt for hver behandlingstilstand og repræsentere dataene som en overlevelseskurve (du bør bruge mindst tre biologiske gentagelser til din kurve).

En overlevelseskurve kræver, at den overlevende fraktion (SF) af behandlede celler (dette omfatter et forhold mellem de dannede kolonier og de udsåede celler) beregnes og plottes mod behandlingsdosis. Før du kan beregne SF, skal dine cellers udpladningseffektivitet (PE) bestemmes, da forskellige cellelinjer har forskellige udpladningseffektiviteter, og dette påvirker beregningen af overlevelsesfraktionen.

PE er forholdet mellem antallet af kolonier og antallet af celler, der er udsået i dine ubehandlede celler1. Figur 1 viser PE- og SF-formlerne og et eksempel på en overlevelseskurve.

Den manuelle optælling af kolonier er trættende og kan være udsat for bias, så der er udviklet en række frit tilgængelige computerbaserede billedanalyseværktøjer til hurtig og objektiv analyse af billeder af klonogene assays. En værd at nævne er den frit tilgængelige softwarepakke udviklet af Brzozowska et al. (2019), der ikke kun tæller kolonier, men også plotter deres størrelsesfordelinger, hvilket er et andet lag af nyttige oplysninger om cellulær adfærd (se figur 2a).6

Et alternativ til at tælle og kvantificere individuelle kolonier er at bestemme den procentdel af brøndarealet, der er dækket af kolonier (koloniarealprocent) for at kvantificere klonogen cellevækst. Guzmán et al. (2014) har udviklet et frit tilgængeligt ImageJ-plugin kaldet ColonyArea, der gør netop dette (se figur 2b).7Dette er et nyttigt værktøj at bruge, hvis du har sammensmeltede kolonier, der er vanskelige at tælle med øjet eller med kolonioptællingssoftware, eller hvis du ønsker en hurtig analysemetode med høj gennemstrømning.

Figur. 2 | Frit tilgængelige måleværktøjer til klonogene assays. (A) Brzozowska et al. har udviklet software (countPHICS), der tæller kolonier og måler kolonistørrelse.6 (B) Guzmán et al. har udviklet et ImageJ-plugin, ColonyArea, der kvantificerer kolonivækstareal og farvningsintensitet.7

Mærkningsfri, ikke-endpoint, semi-automatiseret klonogene assayprotokol

En nyere artikel af Mayr et al. (2018) beskriver en ny og modificeret klonogene assayprotokol, der bruger et 96-well mikropladeformat og konfluensdetektion til at måle kolonier. Denne metode muliggør omfattende eksperimentelle opsætninger ved hjælp af en 96-well-plade, den er mærkningsfri, har ikke noget farvningsendepunkt, og analysen er halvautomatisk (figur 3)8. Desuden viste en tidsopløst konfluensmåling uden endepunkt i den samme brønd, at den halvautomatiske analyse var egnet til bestemmelse af koloniantal og gennemsnitsstørrelse.

Figure. 3 | Mayr et al. evaluerede klonogen vækst i 96-brøndformatet over tid ved hjælp af konfluensdetektion8. Grafen viser kvantificering af klonogen vækst ved forskellige tidspunkter, og billederne viser specifikke brønde med konfluensdetektion. Grønne pletter repræsenterer områder, der er detekteret af en konfluenslæser, og orange pile angiver sammensmeltede kolonier.

Denne klonogene assaymetode giver et tids- og omkostningseffektivt alternativ til standardprotokollen til klonogene assays. Da der ikke kræves nogen slutpunktsfiksering og farvning, giver denne protokol mulighed for løbende overvågning og analyse af klonogen vækst. Desuden kan der også udtrækkes yderligere metrikker om kinetikken af kolonivækst i løbet af forsøget. Det miniaturiserede format åbner også mulighed for at teste dyre behandlinger såsom siRNA-baserede eller CRISPR/Cas9-baserede terapier, som ikke ville være gennemførlige med den behandlingsmængde, der kræves for en 6-hullers eller 24-hullers plade. I sidste ende har Mayr et al. vist, at mærkningsfri mikroskopi med konfluensdetektion er en robust og levedygtig mulighed for at måle klonogenicitet.

En mærkningsfri, ikke-endpoint og automatiseret løsning til dine klonogene assays er CytoSMART Omnimed sin koloni-detektionsalgoritme. Kolonidannelse måles over tid i hele brønden med koloniantal, størrelse og cirkularitet. Dine celler behøver ikke at forlade inkubatoren, og der kan opnås cellulære kinetiske oplysninger under kolonidannelsesprocessen (figur 4).

Figur 4 | Automatiseret koloniopsporing ved hjælp af CytoSMART Omni. HEP-G2 leverkræftceller i en 24-hulsplade blev afbildet i 75 timer ved hjælp af CytoSMART Omni, som opbevares i et standard CO2-inkuberingsapparat. Billedet viser en fuld brønd, efter at koloni-detektionsalgoritmen er blevet kørt, med klynger af celler fremhævet af den orange koloni-maske. Koloniantal, størrelse og cirkularitet blev målt gennem hele assayets varighed og er vist i graferne.

Læs mere om alle CytoSMART billeddannelsesløsninger her