Animals
C57BL/6J dyr blev indkøbt fra Jackson Laboratory, Slac Laboratory Animal (Shanghai) og opdrættet i huset. Esr1-2a-Cre (Esr1Cre, #017913) og Vglut2-Ires-Cre (Vglut2Cre, #012569) blev købt fra Jackson Laboratory. Vgat-Cre-linjen (VgatCre) blev tidligere genereret68. Alle Cre-linjer blev avlet på C57BL/6J-baggrund i mindst én generation. Dyrene blev opstaldet i Institute of Neuroscience dyrefacilitet på 12 h:12 h lys/mørke-cyklus med mad og vand ad libitum. Kun heterozygote dyr af Cre-alleler blev anvendt i undersøgelsen. Alle eksperimentelle protokoller blev godkendt af Komitéen for dyrepleje og brug af Institute of Neuroscience, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina (IACUC No. NA-016-2016).
Kirurgi
Voksne mus 2-4 måneder gamle blev bedøvet med isofluran (0.8-5%) og placeret i en stereotaktisk ramme (David Kopf Instrument, Model 1900). Der blev påført øjensalve for at forhindre dehydrering. Kraniet blev blotlagt med et lille snit, og der blev boret huller til at injicere virus med glaspipetter (15-25 μm i diameter ved spidsen) og til at implantere optiske fibre. Koordinaterne for virustilførsel i mPOA var AP, -0,16 mm; ML, ±0,4 mm; DV, -5,150 mm (Paxios and Franklin mouse brain atlas, 2. udgave). 100-400 nl virus blev injiceret pr. side med en strømningshastighed på 70 nl pr. minut ved hjælp af en hjemmelavet nanoliter-injektor eller med 40 nl pr. minut ved hjælp af en hydraulisk pumpe (Harvard Apparatus). Glaspipetterne blev efterladt på plads i ca. ~10 min efter injektionen, før de blev trukket tilbage. Monooptiske fibre (diameter, 200 μm; N.A., 0.37; længde, 6 mm; AniLab Software and Instruments Co., Ltd) eller dobbelte optiske fibre (DFC_200/245-0.37_6.0mm_DF0.9_FLT; Doric Lense) blev placeret 400 μm over virusinjektionsstedet for optogenetiske eksperimenter eller 50 μm over for fiberfotometrioptagelser. Optiske fibre blev fastgjort med tandcement og kranieskruer. Kuldkammerater blev tilfældigt udvalgt til at blive injiceret med enten eksperimentel eller kontrolvirus. Kastrationsoperationer blev udført med dyr bedøvet med intraperitoneal (i.p.) injektion af ketamin (80 mg kg-1) og xylazin (8 mg kg-1). Dyrene fik 3-4 uger til at komme sig efter operationer før efterfølgende adfærdstest.
Virus
Adfærdstest
Alle adfærdstest blev indledt mindst en halv time efter mørkecyklussens begyndelse og blev optaget ved hjælp af et infrarødt kamera med en billedhastighed på 25 Hz og bedømt af forsøgspersoner, der var blinde for de involverede dyrs genotype, gruppeoplysninger eller fotostimuleringsstatus. Alle dyr, der blev testet for adfærd, undtagen dem, der blev brugt i optogenetiske hæmningsforsøg, var naive jomfrumus før testen. I optogenetiske hæmningsforsøg blev alle hanmusene anbragt sammen med hunmus, og nogle af dem blev fædre før forsøget, mens nogle hunmus blev anbragt sammen med hvalpe eller parret for at blive mødre eller blev behandlet med flere ugers testosteroninjektion før forsøget. Bortset fra dyr, der blev brugt i optogenetiske aktiveringsforsøg, blev alle dyrene opstaldet enkeltvis 3-7 dage før adfærdstest.
For parringsadfærdstests blev en hormonelt primet ovariectomiseret C57BL/6-hun introduceret til hjemmeburet og videooptaget i 30 min. Parringsadfærdstest blev gentaget tre gange med forskellige stimulusdyr med mindst tre dages mellemrum. Forældreadfærd blev testet ved at sprede tre unger i alderen P1 til P4 ud i kanten væk fra reden og videofilme dyret i ~15 min. og blev gentaget 2-3 gange. Territorial aggression blev testet ved at introducere en indtrængende mus af Balb/c-stamme købt hos Slac Laboratory Animal (Shanghai) til det testede dyrs hjemmebur og videofilme i ~15 min.
Videoer blev manuelt annoteret på frame-by-frame-basis ved hjælp af et specialskrevet MATLAB-program som tidligere beskrevet8. Adfærd blev scoret i henhold til følgende kriterier: næse-til-ansigt, næse-til-krop eller næse-til-urogenital kontakt initieret af de testede dyr scorer kollektivt som “social undersøgelse”, hvoraf næse-til-urogenital kontakt specifikt er defineret som “kemoinvestigation”, også kendt som “sniff”. “Mount” scorer man, når forsøgsdyret placerer sine forben på ryggen af stimulus, klatrer op på toppen og bevæger bækkenet. Rytmiske bækkenbevægelser efter mount scorer man som “Pelvic thrust”. Handlinger, der iværksættes af det hjemmehørende dyr mod en indtrængende han, herunder udfald, bid og tumlen, scorer man som “angreb”. “Hvalpekontakt” scorer man, når et dyr har kontaktet en hvalp med næse eller mund. “Henter ungen” scorer man, når et dyr holder ungen med munden og bevæger sig, normalt mod reden. “Crouching” (krumning) scorer man, når dyret bøjer ryggen og svæver over ungerne i reden. Hvalpene blev altid inspiceret efter adfærdsforsøget for eventuelle sår. Ca. 2 % af adfærdsforsøgene resulterede i sårede hvalpe. Udelukkelse af disse forsøg havde ingen indflydelse på nogen konklusion.
Optogenetisk aktivering
Dyr, der blev anvendt til optogenetiske eksperimenter, blev opstaldet i grupper. På dagen for adfærdsforsøget blev de sat ind i et nyt bur. Der blev anvendt en ekstern optisk fiber til at forbinde en 473 nm laserstrømkilde (Shanghai Laser and Optics Century Co. eller Changchun New Industries Optoelectronics Tech Co., Ltd.) med den implanterede optiske fiber i dyret. Den eksterne optiske fiber blev fastgjort til et drejeled (FRJ_1 × 1_FC_FC_FC, Doric Lense) for at give dyret mulighed for at opføre sig frit. Det testede dyr fik lov til at udforske buret i ~15 min. med den eksterne fiber fastgjort. Derefter blev der startet et brugerdefineret MATLAB-program til at styre en Master 9 (A.M.P.I.), som sendte en udløser til at starte optagelsen fra kameraet og signaler til laseren for at levere 15 s fotostimulering ved 40 Hz 12 mW eller 20 Hz 5 mW med 90-120 s tilfældige mellemrum. Lasereffekten blev justeret for hvert dyr i overensstemmelse med den implanterede optiske fibers luminans transitivitetseffektivitet, der blev målt før implantationen for at sikre effekten af det lys, der udsendes ved spidsen af fiberen. Under laserstimulering blev dyrene enten testet alene for lokomotion eller sammen med en hormonelt primet ovariectomeret hun, en C57BL/6-han, en ung rotte i alderen P13-P15, unger i alderen P1-P4 eller gummiblokke af lignende størrelse af unger som stimulus. Der blev givet fem til tolv stimuleringer i løbet af hvert forsøg. Der blev udført et-fire forsøg med hver stimulus (med 3-5 minutters mellemrum) på en given dag for hvert dyr. Efter afslutning af alle adfærdstest blev dyrene givet tog af fotostimulering (15 s, 12 mW, 40 Hz, 10 gange, et fast 105 s interval) og perfunderet transcardialt med 4% paraformaldehyd en time efter lysstimulering med henblik på histologisk analyse. Der blev også indsamlet blod på aflivningstidspunktet til hormonelle målinger.
Fiberfotometri
Dyr, der blev anvendt til fiberfotometriforsøg, blev opstaldet enkeltvis 3-7 dage før adfærdsundersøgelser. På forsøgsdagen blev den implanterede optiske fiber forbundet til F-scope (Biolink Optics Technology Inc., Beijing), en integreret fiberfotometrioptagelse, via en ekstern optisk fiber. I F-scope reflekteres en 488 nm excitationslaser (OBIS 488LS; Coherent) fra et dichroisk spejl (MD498, Thorlabs). Emissionssignalerne, der opsamles gennem den implanterede optiske fiber, filtreres med et båndpasfilter (MF525-39, Thorlabs) og ledes til et fotomultiplikatorrør (PMT, R3896, Hamamatsu). Under optagelserne blev lasereffekten justeret for hvert dyr i overensstemmelse med den implanterede optiske fibers luminansoverførbarhedseffektivitet for at sikre, at det lys, der udsendes ved fiberspidsen, var ~30 μw, og PMT-spændingsforstærkningen blev indstillet til 500 v for GCamp6s-dyr og 300-350 v for kontroldyr. Når det var startet, sendte F-scope-softwaren et udløsningssignal for at starte videooptagelsen fra det infrarøde kamera. Emissionssignalerne blev lavpasfiltreret ved 30 Hz og blev samplet ved 500 Hz med et dataindsamlingskort (USB6009, National Instrument) ved hjælp af en software leveret af Biolink Optics. For et givet forsøg fik dyrene først lov til at udforske i ~5 min, hvorunder baseline-signalerne blev registreret. Derefter blev der introduceret en stimulus såsom en hormonelt primet ovariectomiseret hun, et falsk plastikmuselegetøj, unger i alderen P1-P4 eller gummiblokke af samme størrelse som ungerne. Dyrene fik lov til at interagere og opføre sig med stimuli i 15-90 min før fjernelse af stimuli, hvorefter signalerne blev registreret i yderligere ~5 min.
Optogenetisk hæmning
Dyr, der blev anvendt til optogenetiske hæmningsforsøg, var single housed. Hanmus blev samboende med hunmus for at få seksuel erfaring eller for at blive fædre før forsøg. Jomfruhunmus blev testet som naive dyr for han-typisk parring og for moderadfærd. I tilfælde af dårlig moderadfærd på grundlinjen under den første test blev de sammen med hvalpene anbragt natten over og testet igen for moderadfærd. Efter testning af moderadfærd blev nogle hunner behandlet hver anden dag med subkutan injektion af testosteron (100 μg i 50 μl solsikkeolie, Shanghai Pharm.) i ca. 3 uger, inden de igen blev testet for han-typisk parring. Hunner, der blev testet som mødre, blev parret efter virusinjektion for at producere deres egne hvalpe.
Forinden adfærdstesten blev et dobbelt fiberoptisk patchkabel (DFP_200/230/900-0.37_1m_DF0.9_2FCM, Doric Lense) brugt til at forbinde en 473 nm laserstrømkilde (Shanghai Laser and Optics Century Co. eller Changchun New Industries Optoelectronics Tech Co, Ltd.) til den implanterede dobbelte optiske fiber (DFC_200/245-0,37_6,0mm_DF0,9_FLT, Doric Lense) i dyret via et drejeled (FRJ 1 × 2i FC-2FC 0,22, Doric Lense) for at give dyret mulighed for at opføre sig frit. Efter ~10 minutters ophold blev kameraet udløst til at optage adfærdsprocessen ved hjælp af et signal sendt fra Master 9, som blev styret af et specialskrevet MATLAB-program. For at afgive lys efter tilnærmelse blev lys (~12 mW) automatisk udløst til kontinuerlig afgivelse, så længe det testede dyrs positioner blev registreret af programmet som værende inden for en kropslængde til den hormonelt primerede ovariectomerede hun i parringsadfærdstests eller inden for ungeregionen, som blev defineret ved at markere et lidt større område omkring hver spredt unge i maternelle adfærdstests. Der blev udført mindst to lysforsøg og to forsøg uden lys alternativt for hver test. For at afgive lys efter iværksættelse af defineret adfærd blev blåt lys (~12 mW) af fast længde (5 eller 10 s) udløst manuelt, når eksperimentatoren observerede den pågældende adfærd i realtid. Et eller to lysforsøg blev udført alternativt for hver test.
Fluorescerende immunfarvning
Dyrene blev bedøvet med 10% chloralhydrat og transcardialt perfunderet med PBS efterfulgt af iskold 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS. Herefter blev hjernerne skåret i 40 μm tykkelse ved hjælp af en vibratom (VT1000S, Leica). Sektionerne blev delt ligeligt op i flere sæt og behandlet til farvning eller monteret direkte. Hjernesnit blev blokeret i 5 % gedeserum i AT (0,1 % Triton og 2 mM MgCl2 i PBS) i 1 time ved stuetemperatur og blev inkuberet natten over ved 4 °C i AGT (0,5 % normalt gedeserum, 0.1% Triton og 2 mM MgCl2 i PBS) indeholdende det relevante primære antistof (kanin anti-c-Fos, 1:2000, Santa Cruz, Cat# sc-52; kanin anti-Esr154, 1:10.000, Millipore, Cat# 06-935). Næste dag blev hjerneafsnittene vasket med AGT tre gange (30 min hver) og inkuberet med passende sekundære antistoffer (Alexa Fluor 488-konjugeret, 1:1000; Cy3-konjugeret, 1:1000, Jackson ImmunoResearch) ved stuetemperatur i 2 timer. Hjernesnit blev modfarvet med Neuro Trace (Life Technologies, Cat# N21479, 1:300) eller DAPI (5 mg ml-1, 1:1000, Sigma) i AT. Efter flere vaske i AGT, AT og PBS blev hjerneafsnittene monteret på glasplader.
DAB-farvning
Hjerneafsnittene blev forberedt på samme måde som fluorescerende immunfarveforsøg og blev forbehandlet med 3 % H2O2 i 30 min. ved stuetemperatur for at blokere den endogene peroxidase, vasket to gange i 10 min. hver i PBST (0.3% Triton X-100 i PBS), blokeret med 5% gedeserum i PBST i 2 timer ved stuetemperatur og inkuberet med primært anti-c-Fos antistof (Kanin anti-c-fos, 1:2000, Santa Cruz, Cat# sc-52) i PBST natten over ved 4 °C. Næste dag blev sektionerne vasket seks gange i PBST, 10 min. hver, og derefter inkuberet med biotin-konjugeret sekundært anti-kanin-anti-kanin-antistof fra ged (Cat#111-065-003, Jackson ImmunoResearch) i PBST i 2 timer ved stuetemperatur. Efter tre vaske i PBS, 5 min hver, blev hjernesnit farvet med VECTASTAIN® ABC-reagens i 30 min i henhold til producentens vejledning. Efter to 5 minutters vask i PBS blev hjerneafsnit inkuberet i 3,3-diaminobenzidin (Cat# D5637-5G, Sigma) opløsning med nikkelforstærkning, indtil den ønskede farvestyrke blev opnået. Reaktionen blev stoppet ved at skylle sektionerne i vandhanevand. Hjernesnit blev monteret på glasplader og optaget under ×4- eller ×10-objektiver med konventionelle lysmikroskoper.
In situ-hybridisering
DNA-skabeloner til generering af in situ-sonder blev klonet under anvendelse af følgende primersæt for hvert tilsvarende gen: Vgat, 5′-gccattcagggcatgttc-3′ og 5′-agcagcgtcgtgaagaccaccacc-3′; Vglut2, 5′-atcgactactagtccaaatcttactacggtgctacctcctc-3′ og 5′-atcgctcgagtagccatctttcctgctgttccact-3′; Cre, 5′-ccaatttactgaccgtactacacca-3′ og 5′-tatttacattgattggtccagccaccacc-3′; GAD1, 5′-cattgaggaggagagagagaggttg-3′ og 5′-agagaagagagcgaaggctact-3′; Galanin, 5′-atcctgcactgcactgaccagcccc-3′ og 5′-ttggcttgaggagggggggc-3′. Anti-sense RNA-sonder blev transskriberet med T7 RNA-polymerase (Promega, Cat# P207E) og digoxigenin (DIG)-mærkede nukleotider. Dyrene blev bedøvet med 10 % chloralhydrat og transcardialt perfunderet med DEPC-behandlet PBS (D-PBS) efterfulgt af iskold 4 % paraformaldehyd (PFA) i D-PBS. Herefter blev hjernerne skåret i 40 μm tykkelse ved hjælp af et vibratom (VT1000S, Leica). Hjernesnit blev vasket i 2XSSC-buffer indeholdende 0,1% triton i 30 min, acetyleret i 0,1 M triethanolamin (pH 8,0) med 0,25% eddikesyreanhydrid (vol/vol) i 10 min, equilibreret i præ-hybridiseringsopløsning i 2 h ved 65 ℃ og efterfølgende inkuberet med 0,5 μg ml-1 af specifikke RNA-sonder i hybridiseringsbuffer natten over ved 65 ℃. Den næste dag blev sektionerne skyllet i præ-hybridiseringsopløsning og præ-hyb/TBST (TBS med 0,1 % tween-20) i 30 min hver. Derefter blev sektionerne vasket med TBST to gange og TAE tre gange, hver i 5 min. Sektionerne blev derefter overført til brønde i 2% agarosegel, som blev kørt i 1XTAE ved 60 V i 2 timer for at fjerne uhybridiserede prober. Sektionerne blev derefter vasket to gange i TBST og efterfølgende inkuberet med sheep anti-digoxygenin-AP (1:2000, Roche, Cat# 11093274910), undertiden sammen med kanin anti-Esr1-antistof (1:3000, Millipore, Cat# 06-935) med henblik på samfarvning, i 0,5 % blokeringsreagens (Roche, 11096176001) ved 4 °C natten over. Den anden dag blev sektionerne til brightfield-farvning vasket og farvet med NBT (Roche, kat.nr. 1138323213001) og BCIP (Roche, kat.nr. 11383221001) i 4-10 timer ved 37 ℃. Til fluorescerende in situ-hybridisering kombineret med immunhistokemi blev sektionerne først farvet med fluorescerende sekundære antistoffer, efterfulgt af farvning med fast red (HNPP Fluorescent Detection Set, Roche, Cat# 11758888001) og modfarvning med DAPI (5 mg ml-1, 1:1000, Sigma) i PBS. Alle sektioner blev vasket efter farvning og monteret på glasplader. Billeder blev optaget med ×20 objektiv ved hjælp af et konventionelt eller konfokalt mikroskop.
catFISH
De fleste dyr, der blev anvendt i catFish-forsøget, var erfarne. I forbindelse med proceduren fik dyrene to 5-min episoder af sociale interaktioner med en hormonelt primet ovariectomeret hun eller spredte hvalpe med 30 minutters mellemrum. Umiddelbart efter den anden episode blev dyrene bedøvet med 10% chloralhydrat og transcardialt perfunderet med DEPC-PBS efterfulgt af iskold 4% PFA i PBS. Hjernerne blev dissekeret og postfikseret natten over ved 4 °C og dehydreret med 30 % saccharose i DPEC-PBS. Herefter blev hjernerne snittet i 20 μm tykkelse og monteret på SuperFrost Plus®-præparater (Fisher Scientific, kat.nr. 12-550-15). Efter tørring i luften blev objektglassene opbevaret ved -80 °C, inden de blev behandlet i henhold til RNAscope® Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 User Manual (ACD Bio.). Sonder mod c-Fos intron, c-Fos mRNA og Esr1 blev bestilt hos ACD Bio. og anvendt i forsøget. Billeder blev optaget under et ×60-objektiv med et konfokalt mikroskop.
Elektrofysiologiske optagelser
C57BL/6-dyr injiceret med AAV’er, der kodede for ChR2-mCherry i mPOA, eller Esr1Cre-mus injiceret med AAV’er, der kodede for GtACR1, blev bedøvet med isofluran og transkardialt perfunderet med iskold iltet (95% O2/5% CO2) opløsning med højt saccharoseindhold (sammensætning i mM: 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 2 Na2HPO4, 2 MgSO4, 213 saccharose, 26 NaHCO3). Efter dissektion af hjernen blev koronale snit, herunder mPOA, skåret med 250 μm ved hjælp af et vibratom (VT-1200S, Leica) i iskold oxygeneret skæreopløsning. Hjerneskiverne blev derefter inkuberet i kunstig cerebrospinalvæske (ACSF; sammensætning i mM: 126 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1,25 Na2HPO4, 2 MgSO4, 10 glukose, 26 NaHCO3, 2 CaCl2) ved 34 °C i mindst 1 time og blev optaget ved stuetemperatur. Cellerne blev identificeret under fluorescensmikroskop og visualiseret ved infrarød differentiel interferenskontrast (BX51, Olympus). Helcelle-strømklemmeoptagelser blev udført med en MultiClamp700B-forstærker og Digidata 1440A-interface (Molecular Devices). Patch-clamp-elektroden (5-8 MΩ) blev fyldt op med en intracellulær opløsning (sammensætning i mM: 120 K-gluconat, 4 KCl, 10 HEPES, 10 natriumphosphocritin, 4 Mg-ATP og 0,3 Na3-GTP, pH:7,3, 265 mOsm). Til optogenetisk aktivering blev blåt lys (473 nm, 10 ms bredde, 14 mw mm-2, 40 pulser) leveret på skiverne gennem et ×40-objektiv ved hjælp af en X-Cite LED-lyskilde (Lumen Dynamics). Spike-fideliteten i ChR2-eksprimerende neuroner blev målt ved at tælle antallet af lyspulser, der med succes fremkaldte aktionspotentialer ved forskellige frekvenser. Spike fidelity blev gennemsnitligt beregnet på tværs af fem stimulationer og plottet. Til optogenetisk hæmning blev aktionspotentialet i GtACR1-udtrykkende neuroner induceret ved at holde membranpotentialet -48 mW med en strømindsprøjtning, og gentagne kontinuerlige blå lys blev leveret på skiver.
Kalciumafbildning i hjerneskiver
AAV’er, der koder for ChR2 og AAV’er, der koder for GCamp6s, begge drevet af hSyn, blev co-injiceret i mPOA af C57BL/6-dyr. Akutte hjerneskiver, herunder mPOA, blev fremstillet på samme måde som de elektrofysiologiske procedurer, der er beskrevet ovenfor. Calciumafbildning blev udført ved hjælp af et laserscanningsmikroskop med to fotoner (Ultima, Prairie Instruments Inc.) med et 20X/0,95-NA XLUMPLFL-vandindingsobjektiv med 20X/0,95-NA vanddimmersion (Olympus). Ti:safir-laseren blev indstillet til 940 nm, og billeder af en størrelse på 512 × 512 pixel blev optaget gennem 525/70 nm emissionsfilter med en billedfrekvens på 1,2 Hz. Randomiserede tog af 470 nm lys (10 ms puls, 15 s, 8,4 mW mm-2) med forskellige frekvenser (10 Hz, 20 Hz, 40 Hz) blev leveret til skiverne med intervaller på ~2 min. Billeder blev analyseret ved hjælp af ImageJ.
Hormonanalyser
Rumblod blev opsamlet på aflivningstidspunktet før perfusion. Der blev fremstillet serum. Hormontitre blev analyseret ved hjælp af et testosteron-ELISA-kit (DRG Instruments GmbH, Tyskland, Division of ARG international, Inc, Cat# EIA-1559) i henhold til producentens protokoller.
Dataanalyse
Alle koder blev skrevet i MATLAB og anvendt til dataanalyse og er tilgængelige på anmodning. Der blev ikke foretaget nogen beregning af stikprøvestørrelse. Antallet af celler registreret i skive eller talt i farvning og antallet af dyr anvendt til adfærdstest og farvning blev valgt i henhold til den offentliggjorte litteratur af lignende eksperimenter. Datapunkter fra dyr, som efter en histologisk post hoc-analyse blev anset for at være fejlslagne i henhold til forud fastsatte kriterier, blev udelukket fra analysen. I alt blev tre Esr1Cre-hunmus og en Esr1Cre-hunmus, der var injiceret med GtACR1, en VgatCre-hunmus og en VgatCre-hunmus og en Esr1Cre-hunmus, der var injiceret med Casp3, udelukket fra analysen.
For at analysere data fra Ca2+-billeddannelsesforsøg i hjerneskiver blev billederne kvantificeret i ImageJ. Kort sagt blev GCaMP6s+-cellerne skitseret manuelt, og de relative fluorescensændringer (ΔF/F) blev beregnet for hver celle med ligningen ΔF/F = (F-F0)/F0, hvor F0 er den gennemsnitlige pixelintensitet i de sidste 10 billeder før fotostimuleringen og F er den gennemsnitlige pixelintensitet i de første 6 billeder efter fotostimuleringen. Billeder, der blev optaget i fotostimuleringsperioderne, blev udelukket fra analysen. En aktiveret celle blev operationelt defineret som celler, der viste en stigning i ΔF/F, der var 5 standardafvigelser væk fra de gennemsnitlige ΔF/F-værdier målt i 30 frames før den første fotostimulering.
For at analysere lysfremkaldt lokomotion blev bevægelsesspor først ekstraheret ved hjælp af tilpassede MATLAB-koder, som genkender centrroid af et dyr. Bevægelseshastighed blev derefter beregnet i 1 s tidsbins ved at måle den tilbagelagte afstand. De 15 bevægelseshastighedsdatapunkter i en fotostimuleringsperiode blev sammenlignet med tidligere 15 punkter for at teste, om den pågældende lysstimulering inducerede hastighedsforøgelse i det pågældende forsøg. På dyreniveau blev gennemsnittene af bevægelseshastighederne i hver fotostimuleringsperiode sammenlignet med gennemsnittene af bevægelseshastighederne umiddelbart forud for hver fotostimuleringsperiode for at afgøre, om den lysinducerede bevægelseshastighed øges hos det pågældende dyr. I forbindelse med optogenetisk induceret montering og hentning af unger blev videoerne først bedømt blindt. Videoprotokollerne blev derefter afstemt med fotostimuleringsprotokollerne for at udtrække forsøgsprocenten, startlatenstiden og den samlede varighed af fremkaldt adfærd. Kun adfærd, der optrådte under lysstimulering, blev talt med som optogenetisk induceret adfærd. Hvis en adfærd optrådte før, men ikke desto mindre løb ind i en fotostimuleringsperiode, blev en sådan adfærd ikke talt som optogenetisk induceret adfærd. Parametre blev altid gennemsnitligt beregnet på tværs af fotostimuleringsperioder i samme adfærdsforsøg og derefter på tværs af forsøg, hvis der var flere forsøg. For at tegne tidsfordelingen af optogenetisk fremkaldt adfærd blev kun de fotostimuleringsperioder, hvor der optrådte adfærd, brugt til at beregne gennemsnittet. I adfærdsforsøg med en han, en ung rotte eller falske unger blev brugt som stimulus, eller når ChR2-dyr blev kastreret, blev optogenetisk fremkaldt adfærd sammenlignet med spontan adfærd, der opstod i 15 s-perioden umiddelbart forud for fotostimuleringsperioderne.
For at analysere effekten af optogenetisk hæmning på specifik adfærd blev videoer først bedømt blindt. Video logs blev derefter justeret til fotostimuleringslogs for at udtrække adfærdshændelser, der mødte lysstimulering. For at plotte forskellige parametre for specifik adfærd blev adfærdsbegivenheder, der mødte lysstimulering, gennemsnitligt beregnet på forsøgsniveauet, hvis der fandtes flere forsøg, og derefter på dyreniveau. For at plotte akkumulationsfordelingen af specifik adfærd blev kun adfærdsbegivenheder, der mødte lysstimulering, analyseret.
For at simulere et aktiveringscenter for et ChR2-dyr blev et 1100×1500 μm-område med den ene side tæt på midterlinjen og den vinkelrette side tæt på bunden af hjernen beskåret fra hvert koronalt hjerneafsnit og blev ændret til 1 μm pr. pixel. c-Fos-signaler i hver 100×100 μm blev udtrukket halvautomatisk ved hjælp af MATLAB-programmet sammen med ImageJ og summeret i en 11 × 15-matrix i overensstemmelse med deres placering i hvert afsnit. Det gennemsnitlige antal NeuN/HuCD+-celler inden for et kvadrat på 100 μm2 blev anslået til at være ~25. For at beregne koordinaterne for aktiveringscentret langs den lateral-mediale og dorsal-ventrale akse blev tallene inden for 11 × 15-matricen gennemsnitliggjort på tværs af en række hjerneafsnit, der strakte sig anterior og posterior for hvert dyr, og tilpasset med en todimensional Gaussian-funktion i MATLAB. For at beregne den anterior-posterior koordinat for aktiveringscentret blev det samlede c-Fos-tal summeret for hvert hjerneafsnit og tilpasset med en enkelt Gaussisk funktion.
For fiberfotometrieksperimenter blev rå fluorescenssignaler yderligere justeret i henhold til den overordnede tendens for at tage højde for fotoafblegning. Forsøg med jitter, firkantede bølger af signaler eller med ekstremt lavt signal/støjforhold blev udelukket fra yderligere analyse. For den indledende respons blev værdierne for fluorescensændringen (ΔF/F) udledt ved at beregne (F-F0)/F0, hvor F0 er medianen af basislinjefluorescenssignalet. For de fluorescenssignaler, der er tilpasset adfærd, blev data segmenteret baseret på adfærdsmæssige hændelser inden for individuelle forsøg, og gennemsnitlige signaler 10-15 s før adfærdsinitiering blev anvendt som F0. Til analyse af den statistiske signifikans af de to hændelsesrelaterede fluorescenssignaler blev der anvendt t-test med en falsk opdagelsesrate (FDR) på 0,05. For at korrelere Ca2+-transienter og adfærd blev en rampe Ca2+-hændelse talt, når ΔF/F-værdierne var 3 standardafvigelser over basislinjen og varede længere end 2 s. Antallet af Ca2+-hændelser blev talt mellem den første og sidste adfærd og korreleret med antallet af adfærdsbegivenheder i den pågældende periode. Kun adfærdsforsøg, der havde mere end to monteringer og mere end én hentning, blev brugt til korrelationsanalyse.
Histologiske billeder blev optaget med ×20 objektiv på et konfokalt mikroskop, medmindre andet er angivet. Billeder blev behandlet og talt i ImageJ med specialskrevne MATLAB-koder. Alle tællinger blev udført af eksperimentatorer, der var blinde for dyrets køn eller testtilstand. For at analysere den virale ekspression af ChR2 blev co-mærkningen af ChR2, c-Fos og Nissl i det centrale injektionsområde talt manuelt. For at analysere sammærkning af Esr1 og Vglut2, Vgat eller Galanin blev der udvalgt fem relativt faste områder i fem hjerneafsnit med lignende positioner til manuel optælling. For at teste specificiteten af Cre-ekspression i Esr1-cre-dyr blev sammærkning af Esr1 og Cre talt manuelt i forskellige områder af flere snit fra et dyr. For at kvantificere billederne af catFISH-eksperimenter, som blev taget under et ×60-objektiv, blev celler, der var positive for cytoplasmatisk eller nukleær c-Fos og for Esr1, genkendt med DAPI som modfarvning og talt manuelt. For at kvantificere virkningerne af viral ablation af Esr1+-neuroner blev Esr1+-signaler i mPOA som defineret af Allen Brain Atlas talt for begge sider ved hjælp af uvildig stereologi med Stereo Investigator-software (MBF bBioscience). Specifikt ved hjælp af en optisk fraktioneringssonde blev Esr1+-signalerne optalt i en 30×30 μm tælleboks inden for et 100×100 μm prøvetagningsgitter. For at kvantificere virkningerne af viral ablation af Vgat+- eller Vglut2+-neuroner blev hjerneafsnit afbildet med ×10-objektiv via Olympus VS120. Områder, der farvede med Vgat+- eller Vglut2+-signaler inden for mPOA og tilstødende regioner, blev ekstraheret halvautomatisk ved hjælp af MATLAB-koder.
Statistik
For søjlediagrammer præsenteres data som gennemsnit ± s.e.m. I boks- og whiskersplots præsenteres data som min til max whiskers og middelværdien angivet med “+” og medianen angivet med en vandret linje. Medmindre andet er angivet, blev følgende statistiske test udført, og alle test blev angivet som tosidede. Kategoriske data blev analyseret ved hjælp af Fisher’s eksakte test. Parrede data blev analyseret ved hjælp af parretest. Til analyse af den statistiske forskel i akkumulationsfordelingen blev der anvendt to-stikprøve Kolmogorov-Smirnov-test. Data med én uafhængig variabel blev analyseret ved hjælp af envejs ANOVA’er efterfulgt af post hoc-test med Bonferroni-korrektion. Data med to uafhængige variabler blev analyseret ved hjælp af tovejs ANOVA’er efterfulgt af post hoc-test med Bonferroni-korrektion. For andre sammenligninger blev dataene testet for fordelingen med Lilliefors’ normalitetstest for god tilpasning. Hvis data bestod normalitetstesten, blev der anvendt parametrisk test (Student’s t-test). Ellers blev der anvendt en ikke-parametrisk Wilcoxon-ranksummetest. P-værdien og korrelationskoefficienten for Pearsons korrelation blev beregnet ved hjælp af en Student’s t-fordeling for en transformation af korrelationen. *p < 0,05, **p ≤ 0,01, ***p < 0,001.
Databesiddelse
Alle data i denne undersøgelse er tilgængelige på anmodning.